Het kuiken Chorioallantoic membraan in vivo model om Perineural invasie in hoofd en hals kanker te beoordelen

Ethiek statement: alle experimenten met behulp van ratten in dit protocol worden gedaan in overeenstemming met DEC (Institutional Animal Care en use Comite) regels van onze instelling. Experimenten met eieren in deze studie zijn vrijgesteld van DEC regelgeving. 1. incubatie van het ei (geschatte timing: 5 min, dag nul) Ontvang pathogeen-vrije bevruchte commerciële Lohmann witte Livorno eieren, bij voorkeur op de eerste dag na de bevruchting. Incubeer zes eieren per experimentele groep in een Eier bevochtigen incubator bij 38 °C en 54% vochtigheid voor 8 dagen met rotatie per uur. Gebruik regelmatige rotatie van de eieren om te voorkomen dat het embryo vasthoudt aan de Eier membranen.Let op: voor de incubatie, houd de eieren in een koelkast van 18 °C te stoppen embryo ontwikkeling voor een maximum van 1 week. 2. oogst en bereiding van DRGs (geschatte timing: 2 h, dag 8) Opmerking: experimenten met muizen en ratten vereisen goedkeuring van de (DEC). In sommige landen, het gebruik van kippeneieren vereist ook goedkeuring. Krijg zes tot zeven week-oude Sprague Delombaerde ratten (~ 200 g in gewicht) om DRGs te halen.Opmerking: een rat moet opleveren ~ 40 cervicale en thoracale DRGs. muis DRG integreert ook in de nok, nochtans moeten de voorwaarden voor deze soort onafhankelijk worden geoptimaliseerd. In een laminaire stroom kabinet, oogst DRGs van cervicale en thoracale gebieden na het protocol voor muis DRG extractie elders gepubliceerde22. Volg Figuur 2 voor oriëntatie op hoe te oogsten DRGs. Euthanaseren de rat door cardiale punctie na toediening van ketamine/Xylazine geïnjecteerde ze intraperitoneaal. Reinig de rat huid met 70% ethanol en verwijder de rat wervelkolom met behulp van een schaar. Voer geen cervicale dislocatie uit omdat dit de cervicale DRGs zou beschadigen. Scheid de cervicale, thoracale en lumbale regio’s met dezelfde schaar, naar aanleiding van de schematische anatomische representatie en bruto beelden die in de Figuur 2a-D. Plaats de wervelkolom secties in een 10 cm kweekschaal met 1x PBS om de weefsels nat te houden. Met een delicate been schaar, open de wervel botten in de dorsale en buik aspecten, het scheiden van de wervelkolom in twee zijdelingse helften (figuur 2e-F).  Plaats de weefselsecties in een schone 10 cm schotel met verse 1x PBS. Met behulp van een tang, los het ruggenmerg van de wervel botten om de DRGs te visualiseren (figuur 2g). Met fijne pincet die onder elke DRG wordt gehouden, grijp het en trek het uit van de been holte waarin het wordt ingediend. Houd niet de DRG direct omdat dit weefselschade zal veroorzaken. Niet trim de axon bundels uit de DRG (figuur 2H).Nota: Vermijd gebruikend lumbale DRGs aangezien deze integratie in de nok hebben verminderd. Voor DRG regio locatie, volg de Schematische illustratie en de bruto anatomische beelden op Figuur 2a-D. Onmiddellijk na het oogsten, plaats elke DRG in DMEM cultuurmedium aangevuld met 2% penicilline/streptomycine (pen/keelontsteking) en 10% warmte-geïnactiveerd foetale boviene serum (FBS) om te helpen voorkomen dat bacteriële besmetting van de DRGs. groep alle DRGs in dezelfde 6 cm kweekschaal met 4 mL kweekmedium. Na het oogsten van alle DRGs, breng ze naar een nieuwe cultuur schotel met DMEM cultuurmedium aangevuld met 2% pen/keelontsteking plus 10% FBS en met 1,25 µ g/mL rode fluorescerende kleurstof. Incubeer voor 1 uur in de cel kweek incubator. Tijdens deze tijd, bereid de eieren voor om de DRG te ontvangen zoals hieronder beschreven (stap 3).Nota: het interval tussen het oogsten DRGs en voltooiing van fluorescentie het etiketteren zou voldoende moeten zijn om de eieren voor te bereiden; DRGs kan worden gehouden voor een paar uur in de incubator. 3. bereiding van de eieren voor DRG enten (geschatte timing: 1 uur voor een dozijn eieren, dag 8) In een laminaire stromings kast, Dim het licht en transilluminate de eieren om te controleren op levensvatbaarheid en embryonale fase. Uitsluiten eieren met een slechte vasculatuur, niet-bevruchte eieren, of eieren niet in overeenstemming met dag 8 post-fertilisatie. Houd het ei voorzichtig met de natuurlijk voorkomende lucht SAC in de richting van de lichtbron (Figuur 3a). Markeer met een potlood de eierschaal om de openingen te ontvangen (Figuur 3a-B). Eerst, Identificeer de gehechtheid van het ontwikkelende embryo aan de nok als donker bewegend schip dat aan het ei membraan wordt gehecht en merk dit gebied om interventies in deze streek te vermijden. In de tweede plaats, kies het besturingsvenster gebied als een goed vasculaire gebied ten minste 2 cm van het embryo gehechtheid en trek een 1,5 cm diameter cirkel. Ongeveer 1 cm van het bedienings venster, teken een 0,5 cm vierkant in een minder vasculaire gebied. Ten derde, teken de Air SAC regio om het uit te sluiten van de operatiegebied. Markeer het midden van de Air SAC met een kruis. Met een roterend gereedschap en graveer boor, 3 mm in diameter, boor de eierschaal in het gemarkeerde vierkant (figuur 3c). Gebruik botte tang om de eierschaal te verwijderen zonder het verwijderen van de buitenste ei shell membraan (het witte membraan recht onder de schelp) (figuur 3D). Werk zorgvuldig om accidentele perforatie van dit membraan te voorkomen. Maak met dezelfde boor als in stap 3,3 een Pinpoint-perforatie in het gemarkeerde kruis in het lucht SAC-gebied om de luchtstroom in het ei te laten (figuur 3e). Wees voorzichtig niet te veel druk op het ei toe te passen, om te voorkomen dat het breken of beschadigen. Plaats 30 µ L van Peeters in de vierkante opening, over de intacte buitenste ei shell membraan (figuur 3e). Met een 30-G injectienaald, maak een Pinpoint perforatie in de buitenste membraan in dit vierkante gebied (figuur 3F). Plaats het ei in de lichtbron om de lucht SAC te visualiseren. Breng druk op een pipet rubber lamp en plaats deze in de kleine perforatie gemaakt in de lucht SAC gebied (stap 3,4). De druk van de versie in de bol tot u scheiding van de twee membranen in het werkende venster gebied ziet (figuur 3G); Herhaal deze stap zo vaak als je nodig hebt om volledige scheiding van de membranen te bereiken in het besturingsvenster gebied. Herhaal stap 3.1-3.6 voor alle eieren. Met behulp van dezelfde boor als in stap 3,3, boor de circulaire besturingsvenster wordt voorzichtig niet te scheuren de buitenste ei shell membraan (figuur 3H). Reinig het ei oppervlak door zachtjes steken een plakband om alle losse deeltjes te verwijderen. Met stompe Tang, verwijder de eierschaal van het geboorde gebied (figuur 3I-J). Vervolgens, met dezelfde Tang, verwijder de buitenste ei shell membraan (figuur 3k), wordt voorzichtig niet te kleine schelp deeltjes in het ei te voeren om de verontreiniging te minimaliseren. Identificeer de nok ongeveer op 1 cm diepte van het ei oppervlak. Bedek elk geopend ei tijdelijk met paraffine membraan om verontreiniging te voorkomen (figuur l’). Herhaal stap 3.8-3.10 voor alle eieren. Plaats de eieren terug in de Eier incubator zonder rotatie totdat de DRGs zijn klaar voor het enten. 4. enten DRG op de nok (geschatte timing: 40 min, dag 8) Bereid een 6 cm kweekschaal met Peeters medium, om de DRGs te wassen voor de implantatie. Breng de voor bereide eieren naar de cel cultuur laminaire stroming kabinet. Verwijder het paraffine membraan uit het ei (figuur 4a). Met fijne steriele Tang, grijp voorzichtig één DRG van binnen het cultuurmiddel. Dompel het in de Peeters medium om het overtollige medium dat de fluorescerende kleurstof bevat te verwijderen. Houd de DRG zeer zacht; anders zal het vasthouden aan de Tang. Plaats de DRG op de nok, die oppassen niet te punctie het membraan (figuur 4b-C). Indien nodig, gebruik een ander paar tang te helpen ontkoppelen van de DRG van het puntje van de Tang bij het plaatsen van het op de nok.Opmerking: het houden van de DRG nat met Peeters medium zal ook vergemakkelijken detachement van de Tang. Bedek het ei met een steriele transparante film dressing. Bedek alle ramen en perforaties gemaakt in de eierschaal om bacteriële besmetting te voorkomen (figuur 4D). Na het enten DRGs in alle eieren, Incubeer de eieren in een bevochtigen incubator bij 38 °C en 54% vochtigheid voor 2 dagen, zonder rotatie. 5. enten tumorcellen op de nok (geschatte timing: 1 h 30 min, dag 10) Om 48 uur voor het enten van de cellen, plaat de cellen die nodig zijn in de cultuur platen. Bereken 0,5 tot 1 x 106 cellen per ei voor um-SCC-1 cellen om driedimensionale tumoren te genereren in de cam. Wees ervan bewust dat cel nummer kan variëren per cel lijn. Aspireren medium en voeg DMEM cultuurmedium aangevuld met 1% pen/keelontsteking plus 10% FBS en 2,5 µ g/mL van groene fluorescerende kleurstof. Incubeer voor 1 h bij 37 °C in de kweek Incubator van de cel. Vervolgens, sortie fluorescentie intensiteit voort naar de Microscoop, aspireren midden, wassen vroeger van 1x PBS, en toevoegen 0,25% trypsine voor tot aan 10 min. neutraliseren trypsine van DMEM aangevuld medium. Centrifugeer bij 250 x g voor 4 min om een cel pellet te vormen. Aspireren DMEM medium en opnieuw op te schorten in Peeters om de overtollige fluorescerende kleurstof te wassen. Cellen tellen met een hemocytometer. Breng de eieren naar de cel cultuur laminaire stroming kabinet. Open met een schaar en een pincet de transparante film dressing die het ei bedekt (figuur 4e-F). Centrifugeer het berekende aantal cellen opnieuw, aspireren het Peeters medium en opnieuw op te schorten bij een eindconcentratie van 0,5 tot 1×106 cellen per 5 µ l van hetzelfde medium (figuur 4G). Bereid het bedrag dat nodig is voor het totale aantal eieren (5 µ L van de cel schorsing per ei). Plaats 5 µ L van cel oplossing op de nok, ongeveer 2 mm van DRG (cijfer 4h). Houd uniforme afstanden tussen de DRG en cellen. Wees zeer voorzichtig niet te verstoren het ei te minimaliseren verspreiding van de cellen.Opmerking: om te beginnen cel implantatie, kies eieren waarop het CAM oppervlak is visueel droog. Als de oppervlakte te nat is, kunnen de cellen zich verspreiden en vormen geen regelmatige tumors. Bedek het ei met een nieuwe film dressing als in stap 4,4. Enten de cellen in alle eieren. Incubatie de eieren in een bevochtigen incubator bij 38 °C en 54% vochtigheid voor 7 dagen, zonder rotatie. 6. het oogsten van de nok (geschatte timing: 1 h voor dozijn eieren, dag 17) Bereid 6-well-platen met 4%-Paraformaldehyde, pH 7.0, één goed per ei, 2 mL per put. Breng de eieren naar een laboratorium bankje. Met behulp van een naald aan een spuit om de film dressing perforeren, drop rond 300 µ L van het middel over de nok om iets stijven de nok, waardoor het oogst proces. Herhaal dit voor alle eieren. Met een schaar, verwijder de bovenste helft van de eierschaal (waar het bedienings venster zich bevindt) met de nok eraan verbonden (figuur 4i). Verminder de grootte van deze helft tot ongeveer 3 cm in diameter, houdend het gedeelte van de nok waar DRG en de tumorcellen in het centrum werden geënt (figuur 4J). Pak de CAM met fijne Tang en los het uit de eierschaal, terwijl het in het GAASje. Oriënteer de DRG en kankercellen naar boven gericht (figuur 4k-L).Nota: het 3 cm gebied zou zowel DRG als cellen moeten omvatten. De DRG is gemakkelijk te zien als een kleine Brok gehecht aan de nok, maar tumorcellen zijn soms moeilijk te identificeren op het bruto-examen. Alternatief, met een schaar, verwijd het werkende venster verwijderend de eierschaal van de bovenkant van het ei terwijl het houden van de nok op zijn plaats; Verwijder ongeveer 1 cm buiten het bedienings venster (figuur 4m) en IDENTIFICEER de DRG en de cellen op de nok (figuur 4n-O). Met delicate fijne Tang, houd de nok aan een van de randen en til het zachtjes. Met scherpe delicate schaar, snijd de nok voorzichtig om een cirkelvormig gebied te verwijderen, ongeveer 3 cm in diameter (figuur 4p), en plaats de nok in de met DRG en kankercellen naar boven gericht.Opmerking: Vermijd stretching of het vasthouden van de CAM met een tang in meerdere plaatsen om weefselschade die kan genereren microscopische artefacten te minimaliseren. Plaats elke CAM membraan in een put (figuur l.). Voorzichtig de randen van de nok te begrijpen om het weefsel te openen in de gespreide of schud de plaat zachtjes totdat de nok is uitgevouwen, om te voorkomen dat vouwen artefacten. Euthanaseren het embryo (dag 17) door snelle onthoofding. Bevestig de geoogste weefsels in de voor 4 h bij kamertemperatuur. Na fixatie, vervang het middelpunt met 1x PBS en bewaar weefsels in PBS bij 4 °C tot inbedding in paraffine voor het inbouwen. Vermijd over-fixatie die de delicate vasculatuur van de nok zal beschadigen. Met behulp van een fluorescentie stereomicroscoop, foto de membranen binnen 2 dagen na het oogsten om te voorkomen dat het verliezen van TL-signalen.