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Ricerca sul cancro

En Vitro Tumor celular Rechallenge de evaluación predictiva de antígeno quimérico del Receptor de la célula T función antitumoral

Published: February 27, 2019
doi:
10.3791/59275
, , , , ,
1Department of Hematology & Hematopoietic Cell Transplantation, T Cell Therapeutics Research Laboratory,City of Hope Beckman Research Institute and Medical Center, 2Irell and Manella Graduate School of Biological Sciences,City of Hope Beckman Research Institute and Medical Center

Summary

Aquí, describimos un método de cultivo in vitro de co para recurrentemente desafío orientada a tumor las células T, que permite el análisis fenotípico y funcional de la actividad de las células T antitumorales.

Abstract

El campo de la terapia con linfocitos T antígeno quimérico del receptor (CAR) está avanzando rápidamente con mejoras en diseño, métodos de ingeniería genética y optimizaciones de fabricación. Un reto para estos esfuerzos de desarrollo, sin embargo, ha sido el establecimiento de ensayos in vitro que firme selección de los productos de células T coche óptima para el éxito terapéutico en vivo. Ensayos in vitro estándar tumor-lisis a menudo no reflejan el verdadero potencial antitumoral de las células de T automóvil debido al tiempo de la cultura Co relativamente corto y alto célula de T al cociente de los tumor. Aquí, describimos un método de cultivo in vitro de co evaluar T coche celular recursiva matando a potencial alto tumor celular carga. En este ensayo, función citotóxica a largo plazo y capacidad proliferativa de las células de T automóvil se examinan en vitro más de 7 días con objetivos de tumor adicional administradas la cultura Co todos los días. Este ensayo se puede acoplar con activación de células T perfila, agotamiento y fenotipos de la memoria. Usando este análisis, nos hemos distinguido con éxito las diferencias fenotípicas y funcionales de CD4+ y CD8+ coche T células contra el glioblastoma (GBM), reflejando su diferencial actividad antitumoral in vivo en ortotópico modelos de xenoinjerto. Este método proporciona un enfoque fácil para evaluar la potencia de la célula de T coche y aclarar las variaciones funcionales a través de diferentes productos de células T del coche.

Introduction

Inmunoterapia con receptor antígeno quimérico (coche)-Ingeniería de las células T ha visto resultados prometedores contra células B neoplasias malignas1,2,3,4, mientras que el potencial de la focalización de otros tumores sigue bajo la rigurosa investigación5,6,7. Grandes progresos para optimizar la construcción automóvil, proceso de fabricación y pacientes regímenes de pre-infusión6,7,8, y enfoques de la nueva biología sintética se esperan que aumenten sus persistencia, la seguridad y el tumor especificidad9,10. Sin embargo, ha sido difícil y trabajosa para evaluar adecuadamente el potencial terapéutico de las células de T automóvil para orientar la mejor opción para la traducción clínica. El modelo más establecido evaluar la función de la célula de T del coche es en ratones inmunodeficientes xenoinjertos de tumores humanos, por el que las células de T automóvil son examinadas para la eficacia antitumoral y comparadas al celular valorada dosis11,12 , 13 , 14 , 15. estos estudios murinos in vivo son intensivas y desperdiciador de tiempo, sobre todo cuando gran número de parámetros de detección. Estudios más, en vivo pueden ser refrenados por la accesibilidad de las cepas de ratón, instalaciones de cuidado de los animales y técnicas de manejo de animales. Por lo tanto, es necesario desarrollar más convenientes ensayos in vitro que permite lecturas rápidas de la actividad del efector, que también fielmente reflejan la función antitumoral in vivo de estas células T.

Los métodos convencionales para determinar la citotoxicidad de las células T in vitro se han centrado en la detección de degranulación, producción de citoquinas y la capacidad de lisar las células de la blanco marcado con radioisótopos (es decir, ensayos de liberación de cromo). Mientras que estos ensayos son de caracter informativos para la definición de coche T célula especificidad y reconocimiento objetivo redireccionado, a menudo no reflejan el potencial antitumoral in vivo de ingeniería T células12,13,16. En algunos casos, en vitro matando a actividad en ensayos a corto plazo demostró una correlación inversa con función antitumoral in vivo16. Tal inconsistencia es probablemente el resultado de las relaciones de alta efectoras: objetivo (e: t) utilizado en estos ensayos in vitro y por lo tanto la incapacidad para diferenciar los productos de células T del coche que son propensos al agotamiento17. Por el contrario, durante la erradicación del tumor in vivo T las células generalmente responden contra las cargas grandes del tumor, por lo que requiere múltiples rondas de muerte y posteriormente conducir células T diferenciación y agotamiento18,19, 20, que es una de las principales barreras contra la separación efectiva del tumor por coche T células12,13. Mientras tanto, más a corto plazo ensayos in vitro de la matanza también hacen no lectura diferencias en la proliferación de células T, mientras que en coche T célula tratado pacientes la capacidad de expansión de células T auto esta fuertemente correlacionada con respuestas clínicas4. Así, el ensayo in vitro adecuado tendría que recapitular las condiciones de carga del tumor alto, inducción de agotamiento de la célula de T y permite la lectura de la expansión de células T.

Aquí, describimos una estrategia para evaluar las células de T de coche para tumor repetitiva muerte potencial, con un ensayo simple cocultivo in vitro. Parámetros de actividad diferentes células de T effector pueden examinar simultáneamente, incluyendo la matanza de la célula blanco, expansión de células T auto y fenotipos asociados de memoria o agotamiento. Los resultados generados a partir de este análisis se correlacionan bien con el efecto antitumoral in vivo de células T auto y pueden ser aprovechados para evaluar la potencia de los productos de células T del coche. Mientras se describe un ensayo para evaluar las células de T de coche orientada a IL13Ra2 contra primaria GBM líneas21, puede ser adaptado fácilmente a cualquier plataforma de célula de T del coche.

Protocol

La IRB no requiere la revisión de este protocolo. Recibimos muestras de tumor glioblastoma fresco desechados de la ciudad de esperanza patología Departamento de que se cifran, y nuestro laboratorio no puede acceder a la clave. Recibimos a las muestras con datos solamente en estado de enfermedad y tratamiento previo en el momento de la biopsia/resección, sin datos de identificación. 1. preparación de medios de comunicación Preparar medios de células madre neurales para el cultivo de líneas de células primarias de GBM: DMEM:F12, 1:50 B27, 5 μg/mL heparina y 2 mmol/L L-glutamina; complementado con ng/mL 20 factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento básico del fibroblasto (FGF) de ng/mL 20 veces por semana (véase Tabla de materiales). Preparar los medios de comunicación de la célula de T: 15 X-VIVO que contiene 10% de suero fetal de ternero (FCS); complementado con rhIL-2 y 0,5 ng/mL rhIL-15 de 70 UI/mL cada 48 horas (véase Tabla de materiales). Preparar medios de cultivo Co: media de células madre neuronales sin suplemento de EGF y FGF, y añadir 10% FCS. Preparar FACS (FSS) de solución de tinción: HBSS, 2% FCS, NaN3 (0.5 g/500 mL). 2. preparación de las células tumorales GBM Recoger esferas de tumor GBM de paso bajo (TSs) por centrifugación a 300 x g durante 4 min y descartar el sobrenadante.Nota: Tumor GBM esferas (TSs) se generan de resecado tumores como se describió anteriormente22,23,24y mantenido en medios de comunicación neural de células madre en incubadoras con 5% CO2 a 37 ° C. Medios de cultivo Co precalentamiento en baño de agua de 37 ° C. Añadir 1 mL de accutase fría a GBM TSs disociar TSs mediante pipeteo para 30-60 s y dejar de disociación añadiendo 5 mL de medio de cocultivo caliente.Nota: GBM TSs no debe mantenerse en accutase para más de 5 minutos. Cosechar células GBM por centrifugación a 300 x g durante 4 min, descartar el sobrenadante y resuspender las células en 2 mL de medio de cultivo Co. Determinar la concentración de células usando un contador de viabilidad celular.Nota: Viabilidad de las células debe ser > 70%. 3. preparación de células de T automóvil Menos de 24 h antes del ensayo, tomar 100 μl de células de T automóvil cultivadas en un tubo de citómetro de flujo y añadir 2 mL de FSS.Nota: Las células de T automóvil fueron generadas como se ha descrito anteriormente11,21 y cultivadas en medios de comunicación de la célula de T. Centrifugación a 300 x g durante 4 min y descartar sobrenadante. Añadir 2 mL de FSS para lavar las células, centrifugar a 300 x g durante 4 min y descartar el sobrenadante. Se tiñen las células con el anticuerpo apropiado para indicar la expresión de coche a 4 ° C durante 30 minutos.Nota: Por ejemplo, si un coche dirigido de IL13Rα2 descrito anteriormente25 se utiliza, luego la mancha con el anticuerpo anti-IL13. Lavar dos veces con 2 mL de FSS y analizar exn de coche utilizando un citómetro de flujo. Determinar el % de coches en las células T utilizando la estrategia bloquea que se muestra en la figura 1B. En el día de la cultura, cosechar todas las células de T automóvil por centrifugación a 300 x g durante 4 min, descartar el sobrenadante y resuspender las células en 2 mL de medio de cultivo Co. Determinar la concentración de células usando un contador de viabilidad celular.Nota: Viabilidad de las células debe ser > 70%. 4. configurar el tumor — cocultivo de células T Diluir las células del tumor a una concentración de 0,16 millones/mL con medio de cultivo Co. Basado en el coche %, diluir las células de T automóvil a una concentración de 0,04 millones células/mL del coche+ con medios de cultivo Co.Nota: Por ejemplo, si el coche es un 50% y concentración de la célula de T es de 0,4 millones/mL, luego realizar una dilución 1:5 para obtener la concentración final de coche+ 0,04 millones células/mL. Pipetear 100 μl de las células tumorales diluido en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 96 pozos de fondo plano. Pipetear 100 μl de células de T automóvil diluidas en cada pocillo que contiene la mezcla y las células tumorales bien.Nota: Se analizará cada cocultivo de células T tumor en 4 puntos del tiempo. 4-6 repeticiones podrían ser necesarios cada vez punto basado en diferentes análisis, pero < 3 repeticiones por el momento no se recomienda; Vea la tabla 1 para un representante platemap. Mantener la placa a 37 ° C, 5% CO2 incubadora. 5. tumor de la célula Rechallenge Nota: Rechallenge ocurre en 2, 4 y 6 días post la configuración inicial de cocultivo (figura 1A). Cosecha y disociar GBM TSs como se describió anteriormente (pasos 2.1-2.6). Resuspender las células GBM en una concentración de 0,64 millones/mL. Determinar los pozos de la cultura que necesitan rechallenge (ver tabla 1) y retire con cuidado los medios de comunicación μl 50 desde la parte superior de cada pozo. Añadir 50 μl de suspensión celular GBM en cada pozo y mezclar bien, luego vuelva a colocar la placa en a 37 ° C, 5% CO2 incubadora. 6. cosecha de muestras y análisis cytometric del flujo Nota: Las muestras serán cosechadas en el post de días 1, 3, 5 y 7 que la configuración inicial de co-cultivo, con 1, 2, 3 y 4 rondas de desafío del tumor, respectivamente. Solución de tripsina-EDTA 0.05% precalentamiento en baño María de 37 ° C. Determinar los pozos que necesitan recolección y transferencia de los medios de comunicación en una nueva placa de 96 pocillos de fondo redondo. Pipetear 50 μl de tripsina-EDTA en los pozos de digerir células restantes del tumor a 37 ° C durante 5 minutos. Bajo el microscopio, confirman que las células han separado de la parte inferior. Pipetear en la parte inferior bien para resuspender las células separadas, luego transferencia de tripsina-EDTA con células separadas en los pocillos correspondientes de la placa de 96 pocillos de fondo redondo. Centrífuga de la placa de 96 pocillos de fondo redondo a 300 x g, 4 ° C por 4 minutos, luego deseche el sobrenadante. Agregar 200 μL/pocillo de FSS para lavar las células, centrifugar a 300 x g, 4 ° C por 4 minutos, luego deseche el sobrenadante. Resuspender las células en 100 μL/pocillo FSS que contiene anticuerpos (véase Tabla de materiales) y tinción de las células a 4 ° C durante 30 minutos. Añadir 100 μL/pocillo FSS a células, centrifugar a 300 x g, 4 ° C durante 4 min, entonces descartar sobrenadante. Agregar 200 μL/pocillo de FSS para lavar las células, centrifugar a 300 x g, 4 ° C por 4 minutos, luego deseche el sobrenadante. Resuspender las células con 100-200 μL/pocillo de FSS con DAPI de 500 ng/mL, entonces el análisis de muestras por citometría de flujo. 7. funcional y Phen Otypic análisis de las células de T automóvil Recuperar los archivos de datos de citometría de flujo y todos (DAPI-) células vivas (figura 1C) de la puerta. Cuantificar las células tumorales por bloquear el CD45 coche T células por bloquear el CD45 y población– +, coche + población (figura 1C).Nota: Si las células tumorales expresan CD45 (e.g. células del linfoma de Raji), anti-CD3 tinción puede utilizarse para diferenciar las células de T de las células del tumor. Trama de la célula del tumor y número de células T de coche por el curso del tiempo. Identificar la activación de la célula de T por la coexpresión de 4-1BB y CD69.Nota: Estos marcadores de superficie pueden utilizarse para analizar T activación 6-24 h post inicial co cultivo celular. Identificar agotamiento de la célula de T por la expresión de PD-1, LAG-3 y TIM-3. Identificar el estado de la memoria de la célula de T por la expresión de CD45RO y CD62L.

Representative Results

Usando el análisis descrito anteriormente, nos hemos distinguido la potencia diferencial efectoras y matando dinámica mediada por CD4+ y CD8+ coche T las células. Los resultados presentados aquí ilustran la diferencia entre CD4+ y CD8+ coche T células, generadas a partir de un donante sano independiente de nuestra anterior publicación21. A través de un ensayo estándar de la degranulación, pudimos observar que ambos CD4+ y CD8+ coche T igualmente se convirtió en activan las células contra células GBM que expresan el antígeno específico, como lo indica la expresión de CD107a y citoquinas intracelulares (Figura 2A). Sin embargo, usando el ensayo de desafío de tumor repetitiva, encontró que CD4+ pero no CD8+ coche T las células exhiben la capacidad de matar de múltiples asaltos (figura 2B). CD4+ coche T las células también logra mejor expansión en comparación con las células CD8 + durante este ensayo (figura 2C). La diferencia de expansión entre subconjuntos de células T del coche sólo se observaron de D3 después de dos rondas de desafío de tumor (1:12 e: t), mientras que la diferencia de citotoxicidad se observó comenzando en D5 después de tres rondas de desafío de tumor (1:20 e: t), indicando que ensayos a corto plazo no pudieron aclarar las diferencias en la potencia de diferentes productos de células T del coche. Cuando el 1:1 mezcla CD4+ y CD8+ coche T células se aplicaron a este ensayo, se encontraron para superar a CD8+ pero no CD4+ coche T células de citotoxicidad a largo plazo (figura 2B). La expansión de CD8+ coche T las células fue inducida por el CD4 Co aplicado+ de las células, mientras que los CD4+ expansión de células T auto fue inhibida en presencia de CD8+ las células (figura 2C). Para explicar el mecanismo que distingue la actividad efectora entre CD4+ y CD8 células+ T coche, primero confirmamos que 24 h después de la inicial Co cultura, ambos CD4+ y CD8+ coche T células eran comparable activada (figura 3 A). Mientras tanto, como se indica por la expresión CD45RO y CD62L, ambos CD4+ y CD8+ coche T las células demostraron una transición de la central de la memoria (CD45RO+, CD62L+) a memoria efectoras (CD45RO+, CD62L–) fenotipo durante el desafío de tumor repetitiva (figura 3B). A continuación, caracterizamos las células en D3 de este ensayo, un tiempo antes de que los subconjuntos de células T auto comenzaron a mostrar diferencia funcional. Agotamiento de la célula de t fue marcada por la expresión conjunta de receptores inhibitorios PD-1, LAG-3 y TIM-315,21, que demostró que CD8+ coche T las células eran más propensas al agotamiento en comparación con CD4+ coche T células () Figura 3 C). Además, no se observaron diferencias en CD8+ agotamiento de la célula T coche en la presencia/ausencia de CD4 Co aplicado+ las células (figura 3C), indicando que inducida por CD4 CD8+ expansión de células T del coche no es asociado con una mejor función efectora. Juntos, los resultados de este análisis identificaron que CD4+ coche T células CD8 superaron+ células específicamente en citotoxicidad a largo plazo. A pesar de la citotoxicidad a corto plazo similar (1-3 días, una vez rechallenged), CD4+ coche T células efectoras sostenida función reto tumor repetitivo, mientras que los CD8+ las células se convirtieron en agotado y no controlar el crecimiento de células tumorales. Cuando se mezclaron los dos subconjuntos, CD4+ coche T células facilitaron la expansión de CD8 células+ T coche, pero el estado de agotamiento de CD8+ las células no fueron mejoradas, dando por resultado la falta de efecto sinérgico entre los dos grupos. Similar diferencia entre CD4+ y CD8+ coche T las células fue visto en un modelo in vivo como se describió anteriormente21. De hecho, CD8+ coche T células eran capaces de mediar separación a corto plazo de tumor pero seguido con antígeno positivo repetición; en contraste, CD4+ tratamiento de células de T automóvil dio como resultado a largo plazo de la erradicación de tumor21, que es una reminiscencia de su potencial de homicidio repetitivo usando el análisis in vitro del rechallenge. Figura 1 : Esquema y análisis estrategia de ensayo repetitiva. Esquema (A) y línea de tiempo del ensayo de desafío tumor repetitivos. Para cada bien, las células de T automóvil primero fueron cultivadas conjuntamente con las células PBT030-2 GBM (4.000 coches + células, 16.000 células del tumor) y nuevo desafió con 32.000 células tumorales cada otro día (D2, D4 y D6). Análisis de la célula del tumor y número de células de T automóvil, así como fenotipo de la célula de T del coche se realizan en el D1, D3, D5 y D7. (B) estrategia para determinar el % de coches en T que bloquean las células antes de configurar la cultura de cooperación. (C) estrategia de células vivas, células tumorales y las células de T de coche desde el ensayo repetitiva que bloquean. (D) Tumor células número en distintos momentos del ensayo rechallenge, cultivadas conjuntamente con las células de T untransduced. Barras de error = ±SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2 : Repetitiva, análisis revela diferencias en potencia de muerte y proliferativa CD4+ y CD8+ coche T células. Degranulación de (A) y tinción intracelular citoquinas de CD4+ y CD8 células+ T coche después de 5 h de co-cultivo con células GBM (e: t = 1:1). (B) CD4+, CD8+ o mixtos (CD4:CD8 = 1:1) las células de T automóvil fueron aplicadas a análisis de repetitiva, y se cuantificaron células tumorales viables. p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 comparado con CD4+, con ANOVA de una vía de pruebas de comparación múltiple de Bonferroni. (C) CD4+ y CD8+ expansión de células T coche durante ensayo de desafío tumor repetitivos. Comparación de (izquierda a derecha) CD4+ vs CD8+, subconjunto único; CD4+ vs CD8+, dentro del grupo “mixto”; CD4+, solo vs mezclados; CD8+, solo vs mezclados. p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 utilizando la prueba t de Student de una impar. Barras de error = ±SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3 : Análisis del fenotipo de la célula de T durante ensayo repetitiva. (A) 4-1BB y CD69 tinción en las células de T automóvil en D1 del ensayo. (B) CD45RO y CD62L de tinción de células T auto antes de aplicar para rechallenge ensayo (de entrada) y en D3 y D7 del ensayo. (C) la expresión de PD-1, LAG-3 y TIM-3 en las células de T automóvil D3 del ensayo. (Top) Estrategias para identificar las células T expresan receptores inhibitorios de 1, 2 o 3 que bloquean. (Parte inferior) Comparación de: CD4+ las células (único subconjunto), CD8+ las células (único subconjunto), CD8 células+ (dentro del grupo “mixto”). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Tabla 1: Mapa de la placa representativa de configuración rechallenge.

Discussion

Este ensayo de desafío repetitivo tumor células proporciona un enfoque conveniente para evaluar la potencia funcional de células T coche, usando un setup in vitro que recapitula la carga tumoral alta relacionada con modelos de tumores in vivo. Durante este ensayo de 7 días, las células T auto someterse a cuatro rondas de desafío de tumor (cultura Co inicial y rechallenge x 3), creando un ambiente donde agotado de las células T pueden perder su capacidad para responder al desafío del tumor a pesar de una respuesta inicial potente. Eliminación de células de tumor y la expansión de células T auto representan dos lecturas fundamentales que se pueden adquirir de este ensayo, mientras que los fenotipos de las células de T del coche pueden ser analizados fácilmente por la coloración superficiales o intracelulares marcadores que indican activación de la célula de T, agotamiento o memoria. Este ensayo también es conveniente combinar con el análisis imparcial de coche T células transcriptoma proteoma o fósforo-proteoma21,26y polifuncionalidad de la célula de T que se ha adoptado para predecir la respuesta clínica27. Además, las células del tumor se pueden también probar su respuesta adaptativa contra la inmunidad de células T como citoquinas secreción28. Puesto que las muestras se cosechan en varios puntos del tiempo, este análisis permite no sólo estática, sino también un análisis dinámico del comportamiento de la célula T coche cuando responde al exceso de número de las células tumorales.

El ensayo es particularmente potente en comparación de la potencia de efector de las células de T del coche contra el mismo antígeno pero con diferentes diseños o procesos de fabricación. Hemos utilizado este test para identificar que CD4+ coche T células eran capaces de mediar la superior función de generador de efectos a largo plazo que CD8 células de+ 21. También ha demostrado que esa eficacia in vivo del coche se correlacionó con la citotoxicidad en momentos posteriores (D5-D7) durante este ensayo, destacando aún más la necesidad de utilizar desafío tumor repetitivas para evaluación in vitro de células de T del coche. Aunque las células GBM fueron utilizadas como el ejemplo de las células de blanco aquí, este análisis podrían adoptar fácilmente a una combinación de tumor de la célula de T diferentes. En particular, comportamiento de la célula T de coche también puede variar al antígeno diferentes densidades e Ingeniería de las células de cáncer para expresar distintos niveles de antígenos específicos proporcionados la herramienta para investigar acontecimientos secuenciales moleculares al auto reconocimiento29. Por lo tanto, este análisis también pueden ser explotada para examinar el patrón de activación de ciertas células de T automóvil contra diferentes blancos.

Puesto que la viabilidad de las células objetivo y expansión de células T del coche son dos lecturas iniciales de este ensayo, es crítico que todas las culturas del co empezar con viable (> 70%) tumor y las células de T. Al realizar los procesos de nueva provocación, la acción de los medios de aspiración (paso de 5.3) no debe molestar a tumor y células de T en la parte inferior de los pozos, a fin de no introducir variaciones innecesarias de recuentos de las células. Al realizar este análisis en líneas de células suspensión blanco, se recomienda cosechar células restantes por centrifugación antes de rechallenge de tumor de la célula.

Una limitación de este ensayo es que los parámetros de configuración (e: t ratios de co-cultivo inicial y rechallenge) necesita ser ajustado en base a diferentes combinaciones de CAR-tumor. Por ejemplo, si las células tumorales expresan un nivel considerable de moléculas inmuno inhibidora (por ejemplo, PD-L1), un cociente más alto de e: t se recomienda teniendo en cuenta que el general matar a eficiencia se deteriora en comparación con las células del tumor PD-L1-bajo. Antes de aplicar el ensayo de nuevas combinaciones de coche-tumor, se recomienda un estudio piloto para determinar las condiciones óptimas, que generalmente permite que las células T coche más potentes en el ensayo para eliminar > 80% de las células del tumor en el punto final. Puesto que es necesario contacto directo célula-célula respecto mediada por células T a los coches, si las células del tumor eran marcados con fluorescencia, luego el panel de análisis cytometric del flujo debe ajustarse en consecuencia (por ejemplo, si las células del tumor eran marcados con GFP, entonces cualquier conjugado FITC anticuerpos no deberían utilizarse).

La actividad clínica de las células de T automóvil contra neoplasias de células B ha llevado a dos medicamentos aprobados por la FDA. Sin embargo, la respuesta ha mostrado una variación sustancial en diferentes pacientes27,30,31, que fue aclarada a correlacionar con las propiedades fenotípicas de los productos de coche30. Este ensayo de desafío tumor repetitivo in vitro más proporciona un enfoque para probar funcionalmente la potencia de efector del coche además de la caracterización fenotípica y la polifuncionalidad del cytokine producción y permite la detección de un mayor rendimiento de productos clínicos en comparación con modelos in vivo del tumor conservando la fidelidad predictiva. En general, este análisis podrían utilizarse para la prueba funcional de la célula de T para el diseño de células de T automóvil, desarrollo preclínico y clínico.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por becas del Instituto de California de medicina regenerativa (CIRM) grant 05641 TR3 y subvenciones de NIH CA33572 P30 (núcleos). D.W. es apoyado por becas NCI 1F99CA234923-01.

Materials

0.05% Trypsin/0.53mM EDTA in HBSS w/o Calcium and Magnesium Corning MT25051CI
1M Hepes Irvine Scientific 9319
200 mM L-Glutamine Cambrex Bio Science 17-605E
4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) – FluoroPure grade Invitrogen D21490
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
Aldesleukin Proleukin (rhIL-2) Novartis Oncology NDC 0078-0495-61
Anti-CD137, PE BD Biosciences 555956 4B4-1
Anti-CD19, PE-Cy7 BD Biosciences 557835 SJ25C1
Anti-CD3, PERCP BD Biosciences 340663 SK7
Anti-CD4, FITC BD Biosciences 340133 SK3
Anti-CD45, PERCP BD Biosciences 340665 2D1
Anti-CD45RO, PE BD Biosciences 561137 UCHL1
Anti-CD62L, APC BD Biosciences 559772 DREG-56
Anti-CD69, APC BD Biosciences 340560 L78
Anti-CD8, APC-Cy7 BD Biosciences 348793 SK1
Anti-IL-13, PE BD Biosciences 340508 JES10-5A2
Anti-LAG-3, PE eBiosciences 12-2239-41 3DS223H
Anti-PD-1, APC-Cy7 BioLegend 329921 EH12.2H7
Anti-TIM-3, APC eBiosciences 17-3109-42 F38-2E2
B-27 Serum-Free Supplement (50X) Invitrogen 17504-044
Corning 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile (Product #3596) Corning Life Sciences 3596
Defined fetal bovine serum,HI IR Hyclone Labs SH30070.03IH
DMEM F-12 50:50 (1X) w/o Glutamine MediaTech, Inc. 15-090-CV
DMEM High Gluc w/o L-Glu, Na Pyr 1 L Invitrogen 11960051
DMEM-Ham's F12 50:50 Mixture with L-glutamine and 15 mM HEPES Fisher Scientific MT10092CV
HBSS Irvine Scientific 9224
Heat-Inactivated FCS Hyclone SH30070.03
Heparin Sodium(1,000 U/ml) American Pharmaceutical 401811B
MACSQuant Milteni Biotech Inc. BIS013220 
PBS 1X W/CA & MG Irvine Scientific 9236
PBS with 1MM EDTA (No Ca2+ or Mg2+) VWR Scientific Products PB15009A
Recombinant human EGF R&D Systems 236-EG-200
Recombinant human FGF R&D Systems 233-FB
rhIL-15 Working Dilution (10 ng/µL) CellGenix, US Operations tF0297
Sodium Azide (NaN3) Sigma S8032
Sorvall ST40R Thermo Scientific 41693700
TC-HEPES BUFFER (1M) SOLN 100ML  IRVINE SCIENTIFIC CORP 6472
Tecnol Procedure Mask Kimberly-Clark 47117
X-VIVO 15 Lonza BW04-744Q
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

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Wang, D., Starr, R., Alizadeh, D., Yang, X., Forman, S. J., Brown, C. E. In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function. J. Vis. Exp. (144), e59275, doi:10.3791/59275 (2019).
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