Hier beschreiben wir eine in-vitro-Kokultur Methode rekursiv Herausforderung Tumor gezielt T-Zellen, die phänotypische und funktionelle Analyse der Antitumor-T-Zell-Aktivität ermöglicht.
Bereich der chimeric Antigen-Rezeptor (Auto) T-Zell-Therapie schreitet rasch mit Verbesserungen in der Auto-Design, Gentechnologie Ansätze und Fertigung Optimierungen. Eine Herausforderung für diese Entwicklungsarbeit wurde jedoch die Einrichtung von in-vitro-Untersuchungen, die Auswahl der optimalen Auto T Zelle Produkte für in-vivo Therapieerfolg robust informieren können. Standard in-vitro-Tumor-Lyse-Assays können oft nicht das wahre Antitumor-Potenzial der Auto-T-Zellen aufgrund der relativ kurzen Kokultur Zeit und hohe T-Zell Tumor-Verhältnis zu reflektieren. Hier beschreiben wir eine in-vitro-Kokulturen-Methode zur Evaluierung CAR T Zelle rekursive Potenzial bei hohen Tumor Zelle Lasten zu töten. In diesem Assay, langfristige zytotoxische Funktion und proliferative Kapazität von Auto-T-Zellen werden in Vitro innerhalb von 7 Tagen mit zusätzlicher Tumor Zielen an der Kokultur jeden zweiten Tag verabreicht untersucht. Dieser Test kann mit profiling T-Zellaktivierung, Erschöpfung und Speicher Phänotypen gekoppelt werden. Mit dieser Assay, haben wir erfolgreich die funktionale und phänotypische Unterschiede zwischen CD4 unterschieden+ und CD8+ Auto T-Zellen gegen Glioblastom (GBM) Zellen, reflektieren ihre differentielle in-vivo Antitumor-Aktivität im orthotopen Xenograft-Modelle. Diese Methode bietet einen oberflächlichen Ansatz CAR T Zelle Potenz zu beurteilen und die funktionale Variationen über verschiedene Auto T Zelle Produkte aufzuklären.
Immuntherapie mit Chimären Antigen-Rezeptor (Auto)-entwickelte T-Zellen gesehen hat viel versprechende Ergebnisse gegen B-Zellen Malignome1,2,3,4, während das Potenzial des Zielens anderen Tumoren nach wie vor unter strenge Untersuchung5,6,7. Große Fortschritte erzielt worden, zur Optimierung der Auto-Konstrukt, Herstellungsprozess und geduldig Pre-Infusion Regimen6,7,8, und neuartige synthetische Biologie Ansätze sind voraussichtlich erhöhen ihre Beständigkeit, Sicherheit und Tumor zu Spezifität9,10. Es war jedoch schwierig und arbeitsintensiv das therapeutische Potenzial von Auto-T-Zellen um die beste Wahl für klinische Übersetzung führen entsprechend zu bewerten. Die etabliertesten Modell ist bisher um Auto T-Zellfunktion zu bewerten in immungeschwächte Mäuse mit menschlichen Tumor Xenografts, wobei Auto T-Zellen sind für die Antitumor-Wirkung untersucht und verglichen um betitelten Zelle Dosen11,12 , 13 , 14 , 15. diese murinen Studien in vivo sind arbeitsintensiv und zeitaufwändig, vor allem, wenn große Anzahl von Parametern screening. Weitere, in-vivo Studien können durch die Zugänglichkeit von Mausstämme, Tierbetreuung Einrichtungen und Tier Handhabungstechniken zurückgehalten werden. Daher gibt es eine Notwendigkeit, bequemere in-vitro-Untersuchungen ermöglichen schnelle Ablesung Effektor Aktivität, die auch treu die in-vivo Antitumor-Funktion dieser T-Zellen widerspiegeln zu entwickeln.
Herkömmliche Methoden zur Bestimmung der Zytotoxizität von T-Zellen in vitro konzentrierten sich auf die Erkennung von Degranulation, Produktion von Zytokinen und die Fähigkeit, Radioisotopen-markierten Zielzellen (z.B. Chrom-Release-Assays) zu lösen. Während diese Assays für die Definition von Auto T Zelle Spezifität und umgeleitete Zielerfassung informativ sind, sie nicht oft in-vivo Antitumor-Potential veränderter T Zellen12,13,16wider. Tötung Aktivität in kurzfristige Tests zeigten in bestimmten Fällen in Vitro eine inverse Korrelation mit in-vivo Antitumor-Funktion16. Diese Inkonsistenz ist wahrscheinlich das Ergebnis der hohen Effektor: Ziel (E:T) Verhältnisse in dieser in-vitro-Untersuchungen, und daher die Unfähigkeit, um Auto T Zelle Produkte zu unterscheiden, die anfällig für Erschöpfung17verwendet. Im Gegensatz dazu reagieren während der in-vivo Tumor Beseitigung T Zellen in der Regel gegen großen Tumor Belastungen, damit erfordern mehrere Runden von töten und anschließend fahren T Zelle Differenzierung und Erschöpfung18,19, 20, ist eines der größten Hindernisse gegen effektive Tumor Freigabe durch Auto T Zellen12,13. Unterdessen tun meist kurzfristige in-vitro-Tötung-Assays auch nicht auslesen Unterschiede in der T-Zell-Proliferation, während im Auto T Zelle behandelt Patienten die Kapazität für Auto T Zelle Expansion stark mit klinischen Reaktionen4 korreliert ist. So die entsprechenden in-vitro-Assay müssten Bedingungen hoher Tumorlast, Induktion von T-Zell-Erschöpfung, rekapitulieren und ermöglicht das Auslesen der T-Zell-Expansion.
Hier beschreiben wir eine Strategie, um Auto-T-Zellen für sich wiederholende Tumor töten Potenzial, mit einem einfachen in-vitro-Kokultur Assay zu bewerten. Verschiedene T-Zell-Effektor Aktivitätsparametern können gleichzeitig untersucht werden, einschließlich Ziel Zelle Tötung, CAR T Zelle Expansion und Speicher oder Erschöpfung verbundenen Phänotypen. Die Ergebnisse dieser Assay korreliert gut mit der in-vivo antitumor-Wirkung von Auto-T-Zellen und können genutzt werden, um die Potenz des CAR T Zelle Produkte zu bewerten. Während wir einen Test zur Beurteilung der IL13Ra2 ausgerichtete Auto T-Zellen gegen primäre GBM Linien21beschreiben, kann es leicht zu jedem Auto T-Zelle-Plattform angepasst werden.
Dieser sich wiederholende Tumor Zelle Herausforderung Test bietet eine bequeme Herangehensweise zur Bewertung Auto T Zelle funktionale Potenz, mit einer in-vitro-Setup, das die hohe Tumorlast assoziiert mit in-vivo Tumormodellen rekapituliert. Während dieser 7-Tage-Test CAR T Zellen durchlaufen vier Runden Tumor Herausforderung (erste Kokulturen und 3 X Reprovokation), Schaffung einer Umgebung, wo erschöpfte T-Zellen ihre Fähigkeit zur Reaktion auf Tumor Herausforderung trotz einer starken ersten Reaktion verlieren. Tumor Zelle Beseitigung und Auto T Zelle Expansion repräsentieren zwei grundlegende anzeigen, die von dieser Assay erworben werden können, während die Phänotypen der Auto-T-Zellen leicht analysiert werden können, durch Färbung der Oberfläche oder intrazellulären Marker, die T-Zell-Aktivierung angeben, Erschöpfung und/oder Speicher. Dieser Test ist auch bequem zu kombinieren mit nicht voreingenommen Analyse der Auto T-Zellen Transkriptom, Proteom oder Phosphor-Proteom21,26und T-Zell-Polyfunktionalität angenommenen klinische Reaktionen27vorherzusagen. Tumorzellen können darüber hinaus auch für ihre adaptive Reaktion gegen T-Zell-Immunität wie Zytokin-Sekretion28getestet werden. Da Proben zu mehreren Zeitpunkten geerntet werden, ermöglicht dieser Assay nicht nur statische, sondern dynamische Analyse der CAR T Zelle Verhalten bei der Reaktion auf überschüssige Anzahl von Tumorzellen.
Der Test ist besonders leistungsfähig im Vergleich der Effektor-Potenz Auto T-Zellen gezielt dasselbe Antigen, aber mit unterschiedlichen Designs und/oder Fertigungsprozesse. Wir haben dieser Assay daran gewöhnt, dass CD4 identifizieren+ CAR T Zellen waren in der Lage, hervorragende langfristige Effektor-Funktion als CD8 vermitteln+ Zellen21. Es wurde auch gezeigt, dass die in-vivo Auto Wirksamkeit mit der Zytotoxizität zu späteren Zeitpunkten (D5-D7) während dieser Assay, weitere Hervorhebung der Notwendigkeit mit sich wiederholenden Tumor Herausforderung für in-vitro-CAR T Zelle Bewertung korreliert war. Obwohl GBM-Zellen wie das Beispiel der Zielzellen hier verwendet wurden, könnte dieser Test leicht auf eine Kombination von verschiedenen T-Zell-Tumor übernommen werden. Insbesondere kann CAR T Zelle Verhalten auch auf verschiedenen Antigen dichten und engineering Krebszellen zu verschiedenen Ebenen der gezielten Antigene zur Verfügung gestellt des Werkzeugs, um sequentielle molekularen Ereignisse auf Auto Anerkennung29untersuchen express variieren. Dieser Assay kann daher auch ausgenutzt werden, um die Aktivierungsmuster von bestimmten Auto T-Zellen gegen verschiedene Ziele zu untersuchen.
Da die Zellviabilität Ziel und Auto T Zelle Erweiterung zwei im Voraus Auslesen des Assays sind, ist es wichtig, dass alle Ko-Kulturen mit lebensfähigen beginnen (> 70 %) Tumor und T-Zellen. Wenn die Reprovokation Prozesse durchführen, sollte die Wirkung von Absaugnadeln Medien (Schritt 5.3) Tumor und T-Zellen im unteren Teil die Brunnen, um nicht unnötige Variationen von Zellen zählt einzuführen nicht stören. Bei der Durchführung dieses Assays auf Aussetzung Ziel Zelllinien empfiehlt es sich, die verbleibende Zellen Ernten durch Zentrifugation vor Tumor Zelle Reprovokation.
Eine Einschränkung dieser Tests ist, dass der Setup-Parameter (E:T Verhältnisse der ersten Kokulturen und Reprovokation) angepasst werden muss, basierend auf verschiedenen Auto-Tumor-Kombinationen. Beispielsweise wenn die Tumorzellen ein erhebliches Maß an Immuno-hemmenden Moleküle (z.B. PD-L1) ausdrücken, ein höheres E:T Verhältnis wird empfohlen da die allgemeine Effizienz zu töten ist verglichen mit PD-L1-niedrige Tumorzellen beeinträchtigt. Bevor der Test auf neue Auto-Tumor-Kombinationen eine pilot-Studie wird empfohlen, bestimmen die optimalen Bedingungen, wodurch in der Regel die stärksten Auto T-Zellen getestet in der Probe zu beseitigen > 80 % der Tumorzellen am Endpunkt. Da direkten Zell-Zell-Kontakt benötigt wird für das Auto T-Zell-vermittelten töten, wenn die Tumorzellen Fluoreszenz-markierten waren, dann das Panel der durchflusszytometrischen Analyse muss entsprechend angepasst werden (z.B. wenn die Tumorzellen GFP markiert, dann jedem FITC-konjugiert waren Antikörpern sollte nicht verwendet werden).
Die klinische Aktivität des Auto-T-Zellen gegen B-Zell-Tumoren führte zu zwei FDA-zugelassene Medikamente. Die Antwort hat jedoch erhebliche Unterschiede in verschiedenen Patienten27,30,31, gezeigt die korrelieren mit der phänotypischen Eigenschaften des Auto Produkte30aufgeklärt wurde. Dieser in-vitro-sich wiederholende Tumor Herausforderung Assay weiter bietet einen Ansatz zur funktional testen Sie die Auto-Effektor Potenz neben der phänotypische Charakterisierungen und Polyfunktionalität Cytokine Produktion und ermöglicht höhere Throughput Screening von Klinische Produkte im Vergleich zu in-vivo Tumormodellen unter Beibehaltung der prädiktiven Treue. Alles in allem könnte dieser Assay für T-Zell Funktionstest für Auto T Zelldesign, präklinische und klinische Entwicklung verwendet werden.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse vom California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Grant TR3-05641 und NIH-Stipendien P30 CA33572 (Kerne) unterstützt. D.w. wird unterstützt von NCI-Stipendium 1F99CA234923-01.
0.05% Trypsin/0.53mM EDTA in HBSS w/o Calcium and Magnesium | Corning | MT25051CI | |
1M Hepes | Irvine Scientific | 9319 | |
200 mM L-Glutamine | Cambrex Bio Science | 17-605E | |
4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) – FluoroPure grade | Invitrogen | D21490 | |
Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
Aldesleukin Proleukin (rhIL-2) | Novartis Oncology | NDC 0078-0495-61 | |
Anti-CD137, PE | BD Biosciences | 555956 | 4B4-1 |
Anti-CD19, PE-Cy7 | BD Biosciences | 557835 | SJ25C1 |
Anti-CD3, PERCP | BD Biosciences | 340663 | SK7 |
Anti-CD4, FITC | BD Biosciences | 340133 | SK3 |
Anti-CD45, PERCP | BD Biosciences | 340665 | 2D1 |
Anti-CD45RO, PE | BD Biosciences | 561137 | UCHL1 |
Anti-CD62L, APC | BD Biosciences | 559772 | DREG-56 |
Anti-CD69, APC | BD Biosciences | 340560 | L78 |
Anti-CD8, APC-Cy7 | BD Biosciences | 348793 | SK1 |
Anti-IL-13, PE | BD Biosciences | 340508 | JES10-5A2 |
Anti-LAG-3, PE | eBiosciences | 12-2239-41 | 3DS223H |
Anti-PD-1, APC-Cy7 | BioLegend | 329921 | EH12.2H7 |
Anti-TIM-3, APC | eBiosciences | 17-3109-42 | F38-2E2 |
B-27 Serum-Free Supplement (50X) | Invitrogen | 17504-044 | |
Corning 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile (Product #3596) | Corning Life Sciences | 3596 | |
Defined fetal bovine serum,HI IR | Hyclone Labs | SH30070.03IH | |
DMEM F-12 50:50 (1X) w/o Glutamine | MediaTech, Inc. | 15-090-CV | |
DMEM High Gluc w/o L-Glu, Na Pyr 1 L | Invitrogen | 11960051 | |
DMEM-Ham's F12 50:50 Mixture with L-glutamine and 15 mM HEPES | Fisher Scientific | MT10092CV | |
HBSS | Irvine Scientific | 9224 | |
Heat-Inactivated FCS | Hyclone | SH30070.03 | |
Heparin Sodium(1,000 U/ml) | American Pharmaceutical | 401811B | |
MACSQuant | Milteni Biotech Inc. | BIS013220 | |
PBS 1X W/CA & MG | Irvine Scientific | 9236 | |
PBS with 1MM EDTA (No Ca2+ or Mg2+) | VWR Scientific Products | PB15009A | |
Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG-200 | |
Recombinant human FGF | R&D Systems | 233-FB | |
rhIL-15 Working Dilution (10 ng/µL) | CellGenix, US Operations | tF0297 | |
Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S8032 | |
Sorvall ST40R | Thermo Scientific | 41693700 | |
TC-HEPES BUFFER (1M) SOLN 100ML | IRVINE SCIENTIFIC CORP | 6472 | |
Tecnol Procedure Mask | Kimberly-Clark | 47117 | |
X-VIVO 15 | Lonza | BW04-744Q |