ויזואליזציה של Sulcus עינית הממונה במהלך מופרה רזבורה rerio
Summary
כאן, אנו מציגים סדרה סטנדרטית של פרוטוקולים להתבונן sulcus עינית, נעלה את מבנה שזוהתה לאחרונה, והתפאורה אבולוציונית בעיניים חוליות. באמצעות רימות דג זברה, נדגים טכניקות הדרושות כדי לזהות גורמים שתורמים היווצרות וסגירת sulcus עינית מעולה.
Abstract
Coloboma עינית מולדת היא הפרעה גנטית זה בדרך כלל נצפית כמו בקע בהיבט נחות של העין הסגר פיסורה דמית העין לא שלם. לאחרונה, הזיהוי של אנשים עם coloboma בהיבט מעולה של איריס, רשתית, עדשה הובילו הגילוי של מבנה הרומן, מכונה מעולה פיסורה או sulcus עינית סופריור (SOS), כי קיים transiently על מהראש ההיבט של גביע הראייה במהלך התפתחות העין חוליות. למרות המבנה כולו על פני עכברים, חומוס, דג, ניוט, ההבנה הנוכחית שלנו של אות המצוקה היא מוגבלת. כדי להבהיר גורמים שתורמים שלה היווצרות, הסגר, זה הכרחי כדי שניתן יהיה לבחון אותה ולזהות מומים, כגון עיכוב הסגר ה’אס. כאן, אנחנו יצא כדי ליצור סדרה סטנדרטית של פרוטוקולים יכול לשמש ביעילות להמחיש אות המצוקה על ידי שילוב של טכניקות במיקרוסקופ נרחב זמין עם טכניקות ביולוגיה מולקולרית נפוצות כגון צביעת immunofluorescent mRNA ביטוי. בעוד זו קבוצה של פרוטוקולים מתמקד היכולת להתבונן SOS הסגר עיכוב, היא יכולת הסתגלות לצרכים של הנסיין, ניתן לשנות בקלות. בסך הכל, אנו מקווים ליצור שיטה נוחה שדרכו ניתן מתקדמים ההבנה שלנו של אות המצוקה כדי להרחיב את הידע הנוכחי של התפתחות העין חוליות.
Introduction
היווצרות של העין חוליות הוא תהליך מאוד שנשמרת בו מתוזמר בקפידה איתות המסלולים המערכת לקבוע סוגי רקמות, ציין הזהות האזורית1. לפליטת עד תחילת מורפוגנזה עין לגרום פגמים מעמיקה הארכיטקטורה של העין, לעתים קרובות מסנוור2. מחלה אחד כזה נובע הכשל כדי לסגור את פיסורה עינית דמית העין בצד הגחוני של גביע אופטיים3. הפרעה זו, המכונה coloboma עינית, מעריכים כי ב- 1 מתוך 4-5000 לידות חי ו- % 3-11 לגרום לעיוורון בילדים, מפגין נפוץ כמו מבנה דמוי מנעול זה בולטת האישון במרכז עין4, נלסון! 5,6. הפונקציה של פיסורה דמית העין היא כדי לספק נקודת כניסה מוקדמת להערכת גדל לתוך הכוס אופטיים, לאחר מכן צידי פיסורה הפתיל כדי להקיף את כלי7.
בעוד coloboma עינית ידוע מאז ימי קדם, לאחרונה זיהינו תת-קבוצה הרומן של coloboma חולים עם איבוד רקמות המשפיעים על ההיבט סופריור/הגבי של העין. עבודה במעבדה שלנו הובילה לגילוי של מבנה עינית בעין דג זברה הגבי, שאותם אנו מכנים sulcus עינית סופריור (SOS) או פיסורה מעולה8. חשוב לציין כי המבנה יש מאפייני sulcus והן סדק. בדומה sulcus, זה שכבת רקמת מתמיד החובקת מ אפי אל הרשתית טמפורלית. בנוסף, הסגר של המבנה שאינו מתווך על ידי שילוב של השניים מנוגדים קרום המרתף, ונראה לדרוש morphogenetic תהליך שבו המבנה מאוכלס על ידי התאים. עם זאת, בדומה סדק, היא יוצרת מבנה המפריד את האף ובצד הטמפורלי של העין הגבי עם קרום המרתף. עקביות, נתייחס אליו כמו SOS בטקסט זה.
אות המצוקה אבולוציונית כולו לאורך החוליות, להיות גלוי במהלך מורפוגנזה עין דג, צ’יק, ניוט ו העכבר8. בניגוד פיסורה דמית העין, אשר נמצא במקום מ- 20-60 שעות שלאחר ההפריה (hpf) בדג זברה, אות המצוקה הוא מאוד חולף, להיות גלויים בקלות מ- 20-23 hpf, נעדר מאת 26 hpf8. מחקר שנערך לאחרונה במעבדתנו נמצא כי, בדומה פיסורה דמית העין, אות המצוקה ממלאת תפקיד הדרכה כלי הדם בזמן העין מורפוגנזה8. למרות הגורמים השולטים על היווצרות וסגירת אות המצוקה אינם עדיין לגמרי מובנים, הנתונים שלנו הדגש תפקידי עין הגבי הגחוני / תכנים גנים8.
דג זברה היא אורגניזם מודל מצויין ללמוד אות המצוקה. כמערכת מודל, היא מספקת מספר יתרונות בלימוד התפתחות העין: זה מודל חוליות; כל דור תערוכות פוריות גבוהה (~ 200 עוברי); הגנום שלו יש כבר וסודרו באופן מלא, אשר מקלה על מניפולציה גנטית; כ- 70% של גנים אנושיים יש לפחות אחד orthologue דג זברה, שהופך אותו מודל אידיאלי מבוסס-גנטיקה של מחלות אנושיות9,10. והכי חשוב, התפתחותו לוקח מקום חיצוני עם האמא, הזחלים שלה הם שקופים, מה שמאפשר עבור הפריט החזותי של העין לפתח בקלות יחסית11.
בקבוצה זו של פרוטוקולים, נתאר את הטכניקות שדרכו ניתן לאבחן אות המצוקה של דג זברה הזחלים. מגוון רחב של טכניקות הדמיה השתמשו בדוח זה יאפשר התבוננות ברור ה’אס במהלך התפתחות העין נורמלי, כמו גם את היכולת לזהות פגמים הסגר SOS. הפרוטוקולים בדוגמה שלנו יכלול חקירות של Gdf6, BMP מקומית מהראש ועין וסת הידועות של SOS הסגר. יתרה מזאת, טכניקות אלה יכול להיות משולב עם ניסיוני מניפולציות כדי לזהות גורמים גנטיים או סוכנים תרופתי המשפיעים על היווצרות SOS הנכונה וסגירת. בנוסף, כללנו פרוטוקול שדרכו אפשרית ההדמיה פלורסנט של כל קרום התא, המאפשר הנסיין לבחון שינויים מורפולוגיים לתאים שסביבה אות המצוקה. המטרה שלנו היא להקים קבוצה של פרוטוקולים סטנדרטיים יכול לשמש בכל רחבי הקהילה המדעית להציע תובנות חדשות זה מבנה הרומן של העין המתפתח.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מציגים סדרה סטנדרטית של פרוטוקולים להתבונן על המצוקה של העובר המתפתח דג זברה. כדי לקבוע פנוטיפים עיכוב הסגר, פרוטוקולים שלנו התמקדו היכולת להבחין בהפרדה בין שתי האונות דיסקרטית של הצד הגבי-אפיים ואת הגבי-טמפורלית של העין, דומה טכניקות השתמשו כדי להמחיש פיסורה דמית העין הסגר עיכוב…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קנדי מוסדות של הבריאות מחקר (CIHR), מדעי הטבע, המועצה מחקר הנדסי (NSERC), אלברטה מתפתחת טכנולוגיה עתידיות, ונשים, מכון מחקר בריאות (WCHRI לילדים).
Materials
| 1-phenyl 2-thiourea | Sigma Aldrich | P7629-10G | |
| 100 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 35 mm Petri dish | Corning | CLS430588 | |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | AGA001.1 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| DIC/Fluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z1 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX12 | |
| Dissection microscope camera | Qimaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Dow Corning High-vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma Aldrich | A5040-25G | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Image capture software | Zeiss | ZEN | |
| Incubator | VWR | Model 1545 | |
| Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Minutien pin | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148-500G | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2 | Fisher Scientific | BP1752-100 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P4850 | |
| Rabbit anti-laminin antibody | Millipore Sigma | L9393 | |
| TURBO Dnase (2 U/µL) | Invitrogen | AM2238 | |
| Ultrapure low-melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525017 |
Riferimenti
- Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, (2001).
- Slavotinek, A. M. Eye development genes and known syndromes. Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).
- Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience. Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).
- Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E. Ocular colobomata. Survey of Ophthalmolgy. 45, 175-194 (2000).
- Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma. European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).
- Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. Uveal coloboma: clinical and basic science update. Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).
- Kaufman, R., et al. Development and origins of Zebrafish ocular vasculature. BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).
- Hocking, J. C., et al. Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye. PLOS Genetics. 14 (3), (2018).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Developmental Cell. 21 (1), (2011).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
- Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139, 359-372 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. Stages of Embryonic Development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (79), e50525 (2013).
- Percival, S. M., Parant, J. M. Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (113), e54218 (2016).
