Schwimmen induzierte Paralyse zu beurteilen Dopamin Signalisierung in Caenorhabditis elegans
Summary
Schwimmen-induziert Lähmung (SWIP) ist ein etablierter Verhaltens-Assay verwendet, um die zugrunde liegenden Mechanismen von Dopamin Signalisierung in Caenorhabditis Elegans (C. Elegans) zu studieren. Allerdings fehlt eine detaillierte Methode, um den Test durchzuführen. Hier beschreiben wir Schritt für Schritt Protokoll für SWIP.
Abstract
Der Swimming-Assay in diesem Protokoll beschrieben ist, dass Synapsen ein gültige Instrument zur Regulierung der dopaminergen Proteine zu identifizieren. Ähnlich wie bei Säugetieren, Dopamin (DA) steuert mehrere Funktionen in C. Elegans einschließlich Lern- und motorische Aktivität. Bedingungen, die DA Version (z. B. Amphetamin (AMPH) Behandlungen) zu stimulieren oder zu verhindern, dass DA Abstand (z. B. Tieren fehlt DA Transporter (Dat-1) die sind unfähig, reaccumulating DA in den Neuronen) erzeugen einen Überschuss an extrazellulären DA schließlich mit dem Ergebnis gehemmte Fortbewegung. Dieses Verhalten ist besonders deutlich, wenn Tiere im Wasser schwimmen. In der Tat, während Wildtyp Tiere über einen längeren Zeitraum zu schwimmen weiterhin, Dat-1 null Mutanten und Wildtyp behandelt mit AMPH oder Inhibitoren der DA-Transporter auf den Boden des Brunnens sinken und bewegen sich nicht. Dieses Verhalten wird als “Schwimmen induzierte Paralyse” (SWIP) bezeichnet. Obwohl der SWIP-Test gut etabliert ist, fehlt eine detaillierte Beschreibung der Methode. Hier beschreiben wir Schritt für Schritt um SWIP durchzuführen. Um den Test durchzuführen, sind späten larvalen Phase 4 Tiere in einer Glasplatte vor Ort mit Saccharose Kontrolllösung mit oder ohne AMPH platziert. Tiere sind für ihr Verhalten schwimmen erzielte durch Visualisierung unter ein Stereoskop manuell oder automatisch durch die Aufnahme mit einer Kamera auf das Stereoskop montiert. Videos werden dann analysiert verwenden eine Tracking-Software, die eine visuelle Darstellung der Prügel Frequenz und Lähmungen in Form von Heatmaps ergibt. Die manuelle und automatisierte Systeme garantieren eine leicht quantifizierbare Auslesen der Schwimmfähigkeit der Tiere und ermöglichen so Screening für Tiere tragen Mutationen innerhalb des dopaminergen Systems oder für zusätzliche Gene. SWIP ist darüber hinaus lässt sich den Mechanismus der Wirkung von Drogen wie AMPH aufzuklären.
Introduction
Tiere führen eine Vielzahl von angeborenen und komplexe Verhaltensweisen, die durch verschiedene Neurotransmitter, die von komplizierten Signalisierung Prozesse koordiniert vermittelt werden. Der Neurotransmitter Dopamin (DA) vermittelt hoch konservierte Verhaltensweisen über Arten, darunter lernen, Motorik und Belohnung Verarbeitung.
Boden-Nematoden C. Elegans, zeigt mit einem relativ einfach und gut gemappten Nervensystem nur 302 Neuronen bestehend deutlich komplexe Verhaltensweisen, darunter viele, die DA wie Paarung, lernen, Nahrungssuche, Fortbewegung und Eiablage geregelt sind 1. unter anderen Funktionen, kurze Lebensdauer, einfache Handhabung und die Erhaltung der Signalmoleküle, markieren Sie die Vorteile der Verwendung von C. Elegans als Modell für die Erforschung der neuronalen Grundlagen von konservierten Verhaltensweisen.
Die Zwitter C. Elegans enthält acht dopaminergen Neuronen; Darüber hinaus enthält das Männchen sechs zusätzliche Paare zur Paarung Zwecke. Wie bei Säugetieren diese Neuronen DA zu synthetisieren und express DA Transporter (DAT-1), ein Membranprotein fand ausschließlich in dopaminergen Neuronen, die transportiert, DA in den synaptischen Spalt zurück in den dopaminergen Neuronen freigesetzt. Darüber hinaus die meisten Proteine, die in jedem Schritt der Synthese, Verpackung und Freisetzung von DA sind hoch konserviert zwischen Würmern und Menschen, und wie bei Säugetieren, DA moduliert Fütterung Verhaltensweisen und Fortbewegung in C. Elegans2.
C. Elegans kriecht auf festen Oberflächen und mit einem charakteristischen Prügel Verhalten im Wasser schwimmt. Interessanterweise Mutanten fehlt Ausdruck des DAT-1 (Dat-1) kriechen normalerweise auf festen Untergrund aber nicht schwimmen als in Wasser untergetaucht aufrecht zu erhalten. Dieses Verhalten wurde schwimmen induzierten Lähmungen oder SWIP bezeichnet. Bisherige Experimenten gezeigt, dass SWIP, teilweise durch ein Übermaß an DA in den synaptischen Spalt verursacht wird, die letztlich die postsynaptischen D2-Like-Rezeptoren (DOP-3) overstimulates. Obwohl ursprünglich in Dat-1 Ko Tiere3identifiziert, SWIP wird auch beobachtet, in Wildtyp Tiere mit Medikamenten dieser Block die Aktivität der DAT (z. B. Imipramin4) behandelt und/oder DA Version (z. B. Amphetamin5) induzieren. Auf der anderen Seite zu verhindern, dass pharmakologische oder genetische Manipulationen Abwendung Synthese und Freisetzung von DA und DOP-3-Rezeptor-Funktion sperren SWIP6. Zusammengenommen haben diese bereits veröffentlichten Daten SWIP als ein zuverlässiges Werkzeug, die Auswirkungen auf das Verhalten verursacht durch mutierte Proteine innerhalb von dopaminergen Synapsen3,4,7 zu studieren und für anzuwendende etabliert leiten Sie genetische Bildschirme für die Identifizierung der neuartige rechtliche Wege DA Signalisierung7,8,9,10,11,12beteiligt. Zusätzlich, indem eine leicht quantifizierbare Auslesen des Medikamenten-induzierten Verhalten bei lebenden Tieren SWIP ermöglicht die Aufklärung der Mechanismen der Wirkung von Drogen wie Amphetamin (AMPH) und Azaperone bei der dopaminergen Synapsen5, 6 , 13 , 14 , 15.
Protokolle für die Durchführung der SWIP-Assays wurden vor16beschrieben. Hier beschreiben wir ausführlich die Methodik und das Setup Ausführen des Tests mit dem Ziel, eine visuelle Anleitung für die Gemeinschaft von C. Elegans SWIP effektiv durchführen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir Schritt für Schritt-Protokoll um einen Verhaltens-Assay, SWIP, in C. Elegansdurchzuführen. Dieses Protokoll ist einfach und unkompliziert ohne großen technischen Hürden, die Herstellung dieser Assay sehr benutzerfreundlich. Dennoch gibt es einige kritische Aspekte, die berücksichtigt werden, um effektiv den Test durchführen müssen.
Darauf sollte geachtet werden, um sicherzustellen, dass die Würmer für den Assay verwendet gut genährt, da diätetische Eins…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Dr. Osama Refai von Dr. Randy Blakely Lab zur Orientierung mit der automatisierten Analyse der SWIP danken. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Finanzierung von NIH R01 DA042156, LC.
Materials
| Aluminum foil | Reynolds wrap | 1091835 | |
| Amphetamine | Sigma | 51-63-8 | |
| Autoclave | |||
| Bacterial Incubator | New Brunswick scientific | M1352-0000 | |
| Bacteriological grade, Agar | Lab Scientific, Inc | A466 | |
| Bacto (TM) Peptone | BD | REF 211677 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Thorlabs | U-CMAD3 | |
| Centrifuge | Eppendorf 5810R 15amp | E215059 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | |
| Deionised water | Millipore | Z00QSV0WW | Milli-Q |
| Depression glass spot plate | Corning | Corning, Inc. 722085 | |
| Erlenmeyer flask | ThermoFisher | 4103-0250PK | |
| Eye lash | |||
| Glass slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Graphing and statistical software | Prism | Graphpad 5 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | RB=H3375 & H7006 | |
| Hypochlorite | Hawkins | Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal | |
| LB Broth, Miller | Fisher | BP1426 | |
| Magnesium Chloride (Hexahydrate) | Sigma-Aldrich | RB=M0250 | 500g |
| Magnesium sulfate (heptahydrate) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| Magnetic stir bar | Fisherbrand | 16-800-510 | |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| NA 22 bacteria | CGC | ||
| Nystatin | Sigma | 1400-61-9 | |
| Osmometer | Advanced Instruments, Inc | Model 3320 | |
| Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Petriplates | Falcon | 351007 | |
| pH Meter | Orion VersaStar Pro | IS-68X591202-B 0514 | |
| Polystrine conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Potassium Phosphate – DIBASIC | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| Potassium Phosphate – MONOBASIC | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Serological pipettes | VWR | 10ml=89130-898 | |
| Shaker | Reliable Scientific | 55S 12×16 | |
| Sodium Chloride | Fisher | RB=BP358-1 | |
| Sodium dihydrogen Phosphate | Fisher | RB=S381 | |
| Spreadsheet | MS office | Microsoft Excel | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model tlb3. 1 stemi2000 | |
| Sterile Pipette tips | Various | 02-707-400 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | RB=S5016 | |
| Superglue | Loctite | 1647358 .14 oz. | |
| SwimR sofware | 10.18129/B9.bioc.SwimR | ||
| Tracker 2 | Worm Tracker 2.0 | www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/ | |
| Video recording software | Virtualdub | http://www.virtualdub.org/ |
Riferimenti
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