Mikrobiyal protein ve özel metabolit verilerinin analizi için açık kaynak MALDı TOF-MS ıdbac Pipeline kullanma

1. MALDı matrisinin hazırlanması MS dereceli çözücülerde 10 mg/mL MALDı-Grade ve/veya rerystalize α-Cyano-4-hydroxycinnamic Acid (CHCA) hazırlayın: 50% Asetonitril (ACN), 47,5% su (H2O), 2,5% trifluoasetik ASIT (TFA). Örnek: 100 μL çözeltisi = 50 μL ACN + 47,5 μL H2O + 2,5 ΜL TFA + 1 mg chca MALDı plaka spot ve Vortex başına en az 1 μL matris çözeltisi hazırlayın veya çözüme kadar sonikat (yaklaşık 5 dk sonication veya görünür katılar).DIKKAT: TFA, cilt, gözler ve hava yollarının temas veya inhalasyon ile zarar görmesini sağlayan, uygun kişisel koruyucu ekipman takarken kimyasal duman kaputu içinde ele alınması gereken güçlü bir asittir.Not: CHCA higroskopik ve ışığa duyarlıdır ve bir kurutucu içinde Amber şişeleri içinde depolanmalıdır. Birçok MALDı matris seçeneği mevcuttur. CHCA bakterilerin protein profil için en yaygındır, aynı zamanda özel metabolit analizi için çalışır. Matris seçimi, bireysel kullanıcı/deneme gereksinimlerine bağlıdır. 2. MALDı hedef plakalarının hazırlanması Not: daha fazla ayrıntı için Sauer ve al.7′ ye bakın. MALDı plakasını metanol (HPLC-Grade veya üzeri) ile durulayın ve yumuşak kağıt mendilleri ile kurutun. Bu hedef plakanın yüzeyine kalıcı olarak zarar verebilecek şekilde, hedef plakaları temizlerken aşındırıcı fırçalar kullanmayın. Protein ve özel metabolit kalibreli lekeler atayın. Zaman içinde MALDI-Plate-düzensizlikler ve enstrüman kayması için hesap, örnek nüfus arasında eşit kalibrasyon noktalarını düzenleyin. Çalışma için uygun sayıda ortam/matris boş nokta atayın; Bu noktalar yalnızca medya ve matris veya yalnızca matris içerecektir. Steril bir kürdan kullanarak, bir bakteriyel koloninin küçük bir kısmını MALDı plakasında uygun noktaya aktarın. Bakteri kolonisini yere eşit olarak yayın. Spot mümkün olduğunca düz görünmelidir.Not: daha fazla mukoid/amorf olan bakteriyel kolonileri yassılaştırmak daha kolay olacaktır. Daha sert/katı koloniler için, MALDı spot üzerinde hücre kütlesi görünür kümeleri bırakarak kaçının (Şekil 1). Şekil 1: formülik asit ve MALDı matrisini (ilk 3 nokta- Bacillus Sp.; alt 3 Spotlar- Streptomyces Sp.) eklemeden önce ıkı farklı yalıtılmış gösteren Maldi-Target plakası . Her ikisi için de sütun 3 aşırı örnek temsil eder; sütun 2 örnek uygun miktarını temsil eder; sütun 1 maldı çözümlemesi için yetersiz örneği temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Az miktarda agar/medyayı MALDı plakasında uygun noktaya (ler) aktarmak için steril bir kürdan kullanarak bir matris/medya kontrolü hazırlayın. Matris kontrol noktaları da dahil olmak üzere her örnek noktaya 1 μL 70% Kütle Spektrometrisi sınıf formik asit bindirme. Asitlere kimyasal duman kaputu içinde tamamen kurumasına izin verin (yaklaşık 5 dakika).DIKKAT: formik asit, kostik bir kimyasaldır ve kimyasal duman davlumbazında ele alınması gerekir. Eğer solunabilir hava yolları zarar verebilir. Her örnek noktanın yanı sıra matris/medya kontrol noktalarına hazırlanan MALDı matris çözümünü 1 μL ekleyin. Matris çözümünün tamamen kurumasına izin verin (yaklaşık 5 dakika).Not: bir MALDı-TOF Kütle spektrometresi üzerinde analiz edilebilir kadar, karanlıkta, bir kurutucu plaka saklamak mümkündür. İzin verilen depolama süreleri örnek kararlılığa bağlı olarak farklılık gösterebilir. Atanan kalibrasyon noktaların ardından 1 μL MALDı matris çözeltisi ile 0.5 – 1.0 μL kalibre ekleyin. Elde edilen solüsyonu karıştırmak için yukarı ve aşağı pipet. MALDı-TOF kütle spektrometresine giriş yapmadan önce tüm noktalardan tamamen kurumaya izin verin.Not: protein ve özel metabolit kalibraları, her iki bozulma duyarlı olduğu gibi, MALDı Analizi 30 dk içinde eklenmesi gerekir. 3. veri edinme Not: veri edinme için genel parametreler Tablo 1′ de listelenir. Parametre Protein Uzmanlaşmış metaboliti Kütle başlangıcı (da) 1920 60 Kütle sonu (da) 21000 2700 Kütle sapması (da) 1900 50 Çekim 500 1000 Frekans (Hz) 2000 2000 Lazer boyutu Büyük Orta MaxStdDev (ppm) 300 30 Tablo 1. Kullanılan enstrümana özgü protokollerin ardından hem protein hem de özel metabolit kalibrasyonları ayarlayın. Spektrumları alırken kullanılacak optimum lazer gücünü ve dedektör kazanımı belirlemek için birkaç ayrı hedef spot testi yapın (Bu, günlük ve enstrüman ile değişir).Not: şekil 2A ve şekil 3A optimum spektrumları gösterirken Şekil 2D ve şekil 3D düşük kaliteli spektrumların örnekleridir. Şekil 2: Lazer güç ve dedektör kazanç değiştirme etkisini gösteren örnek protein spektrumları. Spectra kalite panel Aen iyisidir, ve paneller C ve Dyetersiz spektrum kalitesine kadar azalır. Panel B ‘de spektrumunda kullanışlı doruklara neden olabilir, panel A en iyi verileri görüntüler. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Şekil 3: Örnek özel metabolit Spectra lazer güç ve dedektör kazanç değiştirme etkisini gösteren. Spectra kalite panelin en iyisidir A ve paneller C ve Dyetersiz spektrum kalitesi kadar azalır. Panel B ‘de spektrumunda kullanışlı doruklara neden olabilir, panel A en iyi verileri görüntüler. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Spektrum kazanın, bir klasöre protein spektrumları tasarrufu ve ikinci, ayrı bir klasöre özel metaboliti Spectra. 4. MALDı hedef plakasını Temizleme (Sauer ve al.7’ den uyarlanmış) MALDı hedef plakasını kendi tutucusuna çıkarın ve aseton ile durulayın. İzleme proteinlerini ve lipidlerini ve yumuşak kağıt mendilleri/yumuşak kıl diş fırçasını kaldırmak için aşındırıcı olmayan bir sıvı sabun ile yıkayın. Sabun tamamen kaldırmak için yaklaşık 2 dakika için de-iyonize su ile durulayın. Hedef plakayı su içinde (HPLC Grade veya üzeri) 5 dakika boyunca sonikat. Hedef plakayı su ile durulayın (HPLC sınıfı veya üzeri). Hedef plakayı metanol (HPLC sınıfı veya üzeri) ile durulayın. 5. ıdbac yazılımını yükleme Idbac yazılımını indirin.Not: kalıcı, sürümlü yedeklemeler de indirilebilir (bkz. malzeme tablosu). Yükleyici başlatmak için indirilen “Install_IDBac. exe” çift tıklatın ve ekrandaki yönergeleri izleyin. 6. RAW verilerle başlayarak Not: her veri işleme adımının ayrıntılı açıklamaları ve talimatları ıdbac içinde gömülür, ancak ana analizler ve interaktif girişler aşağıda açıklanmıştır. Idbac başlatmak için ıdbac masaüstü kısayolunu çift tıklatın. Idbac varsayılan olarak giriş sekmesinde açılacaktır. Idbac ‘in en güncel sürümünün kullanıldığından emin olmak için Güncelleştirmeleri denetle düğmesini kullanın (internet erişimi gerektirir). Daha yeni bir sürüm varsa, ıdbac otomatik olarak karşıdan yükleyip yükledikten sonra ıdbac yeniden başlatılması isteğinde olacaktır. Ham veri sekmesi ile başlayarak tıklatın ve menüden ıdbac ile kullanılacak veri türünü seçin; Uygulama içi yönergeleri izleyerek devam edin. Veri dosyalarının dönüşümünü ve işlenmesini ayarlarken, istendiğinde deneme için açıklayıcı bir ad girin (bkz. Şekil 4). Denemeler daha sonra alfabetik olarak görüntülenecektir, böylece yararlı bir strateji, deneme adlarını grup özniteliğiyle başlatacaktır (örn., “Bacillus-trials_experiment-1”; “Bacillus-trials_experiment-2”). Şekil 4: IDBac veri dönüştürme ve ön işlem adım. Idbac açık mzML formatında ham Spectra dönüştürür ve her deneme için bir veritabanında mzML, tepe listeleri ve örnek bilgileri depolar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. 7. önceki deneylerle çalışın Dosyaları dönüştürdükten ve onları IDBac ile işlerken veya bir deneyle yeniden analiz etmek istediğinde, önceki deneyler sayfasıyla çalışmaya gidin ve çalışmak Için bir deneme seçin (Şekil 5). Şekil 5: “önceki deneylerle çalışma” sayfası. Çözümlemek veya değiştirmek için bir deneme seçmek için ıdbac ‘s “önceki denemeleri ile çalışma” sayfasını kullanın. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Isteğe bağlı Menü kullanarak örnekler hakkında bilgi ekleme Seçili deneyi değiştirmek için burayı tıklatın. Otomatik doldurulan elektronik tabloya bilgi girin ve Kaydet tuşuna basın (Şekil 6). Bu seçenek, kullanıcının analizler sırasında renk kodu verilerine izin verir. Şekil 6: örnek bilgileri girin. “Önceki deneylerle çalışma” sayfasında kullanıcılar, taksononomik kimlik, toplama konumu, yalıtım koşulları vb. gibi örnekler hakkında bilgi girebilmek Için lütfen buraya tıklayarak bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntüleyebilirsiniz . Isteğe bağlı Önceki deneylerden gelen örnekleri yeni/diğer deneylere aktar ‘ı tıklatarak ve sağlanan yönergeleri Izleyerek (Şekil 7), tüm veya numunelerin bir alt kümesini yeni veya başka bir denemeye aktarın. Şekil 7: verileri aktarın. “Önceki denemeleri ile çalışma” sayfası, varolan denemeler ve yeni deneyler arasında veri aktarımı seçeneği içerir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Analize başlamaya hazır olduğunda, çalışacağı denemenin seçildiğinden emin olun. Protein veri analizi veya küçük molekül veri analizi’ni seçin. 8. protein veri analizi kurma ve ayna çizimleri oluşturma Protein verilerini analiz ederseniz, önce protein veri analizi sayfasına gidin. Üst düzey çekme ayarlarını seçin ve görüntülenen ayna çizimleri aracılığıyla numunelerin protein spektrumları değerlendir (Şekil 8).Not: ayna çizimlerinde, kırmızı bir tepe sadece üst spektrumunda o zirve varlığını belirtir, mavi zirveler her iki spektrum içinde meydana gelen temsil ederken. Şekil 8: doruklarına analiz için nasıl korunur seçin. Analiz etmek için bir deneme seçtikten sonra, “protein veri analizi” sayfasını ziyaret edin ve daha sonra “doruklarda analiz için nasıl tutulur seçin” menüsünü açarak kullanıcıların zirveleri korumak için sinyal-gürültü oranı gibi ayarları seçmesine izin verir. Görüntülenen yansıtma grafiği (veya dendrogram) otomatik olarak seçilen ayarları yansıtacak şekilde güncellenir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Analizlere dahil edilmesi için bir zirvede mevcut olması gereken çoğaltır yüzdesini ayarlayın (örneğin, eşik% 70 olarak ayarlanmışsa ve en az 7 ‘ si 10 çoğaltır içinde bir tepe meydana gelirse, dahil edilecektir). Görsel rehberlik olarak ayna çizimleri kullanarak, daha fazla çoğaltır ve daha yüksek bir “yüzde zirve varlığı” değeri gürültü kesme için daha düşük bir sinyal seçimi izin verir belirterek, en “hakiki” doruklarına ve az gürültü koruyan gürültü kesme sinyali ayarlayın. Idbac tarafından daha fazla analizlerde kullanılacak her spektrumdaki kütle değerlerinin aralığını dikte ederek, alt ve üst m/z cutoffs belirtin. 9. protein verilerini kullanarak kümeleme örnekleri İçinde protein veri analizi sayfa, seçin dendrogram sekmesi. Bu örnekleri bir dendrogram Kullanıcı tarafından seçilen uzaklık önlemleri ve kümeleme algoritmaları göre gruplandırma sağlar. Menüde örnekler Seç ‘e tıklayın ve analizlere dahil edilen örnekleri seçmek için yönergeleri izleyin. Yalnızca protein spektrumları içeren örnekler mevcut numune kutusu içinde görüntülenir (Şekil 9). Şekil 9: görüntülenen dendrogram içinde dahil etmek için seçilen deneyden örnekleri seçin. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Varsayılan değerleri kullanın veya altında kümeleme ayarları seçin, istenen uzaklık ve kümeleme algoritmaları dendrogram nesil uygulanacak seçin. Giriş olarak varlığı/devamsızlık seçeneğini belirleyin. Alternatif olarak, numunelerin tepe yükseklikleri hakkında emin iseniz (örn., en yüksek yoğunluğun değişkenliğini değerlendirmek için bir çalışma yaptıktan sonra), giriş olarak yoğunluklar ‘ı seçin.Not: yayın sırasında ıdbac uygun kombinasyonları seçmek için kullanıcılara güveniyor, kümeleme için ayarları esneklik sağlar. Bu seçenekler ile aşina değilseniz, ya da eşleştirmek için önerilen A: “kosinüs” uzaklığı ve “ortalama (UPGMA)” kümeleme; veya B: “Euclidean” uzaklık ve “Ward. D2” kümeleme. Dendrogram üzerindeki Bootstrap değerlerini görüntülemek için, bootasklarıaltında 2 ile 1000 arasında bir sayı girin. Sonuçları raporlarken, Raporlama protein analizi paragrafı Için öneriler içindeki metni kopyalayın. Bu, belirli dendrogram oluşturulan kullanıcı tanımlı ayarları sağlar. 10. protein dendrogram özelleştirme Dendrogram ‘ı özelleştirmeye başlamak için dendrogram menüsünü ayarlayın (Şekil 10). Şekil 10: Dendrogram ayarlayın. IDBac dendrogram nasıl göründüğünü değiştirmek için birkaç seçenek sağlar, bu menü içinde bulunabilir “Dendrogram ayarlayın”. Bu, k-araçlarla dalları ve etiketleri renklendirme veya bir kullanıcı tarafından sağlanan yükseklikte dendrogram “kesme” içerir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Dendrogram ‘ın çizgilerini ve/veya etiketlerini renklendirmek için uygun düğmeyi seçin: satırları değiştirmek veya etiketleri değiştirmek için tıklayın ve istediğiniz seçenekleri belirleyin. Dendrogram yanındaki elektronik tabloya bilgi çizmek için (bkz: adım 7,2), düğme örnekleri hakkında bilgi birleştirmekseçin. Bu, girilen değerlere göre bir kategorinin (elektronik tablodaki sütunun) kendi kendine dolduracağı bir panel açacaktır (Şekil 11). Şekil 11: örnekler hakkında bilgi ekleyin. “Dendrogram ayarla” menüsü içinde “örnekleri hakkında bilgi birleştirmek” seçeneğidir. Bu seçme, dendrogram yanında örnekleri hakkında komplo bilgileri izin verecektir. Örnek bilgiler “önceki denemeleri ile çalışma” sayfasında girdi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. 11. ayrı bir deney dendrogram içine örnekleri ekleyin Başka bir deneyden örnek eklemek için, başka bir deneyden örnekler eklemekiçin menü düğmesini seçin. Yeni açılan paneldeki yönergeleri izleyin (Şekil 12). Şekil 12: başka bir deney menüsünden örnekler ekleyin. Bazen başka bir denemenin örneklerini karşılaştırmak yararlıdır. Şu anda görüntülenen dendrogram içinde dahil etmek için örnekleri seçmek için “başka bir deneyden örnekler Ekle” menüsünü kullanın. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. 12. özel metabolit veri ve metabolit dernek ağları (MANs) analiz Metabolit dernek ağı (küçük-molekül) sayfasına geçin. Bu sayfa, küçük molekül m/z değerlerinin örneklerle korelasyonunu görüntülemek için iki taraflı ağlar kullanan ilke bileşenleri analizi (PCA) ve MANs tarafından veri görselleştirme sağlar. Eğer bir protein dendrogram (Bölüm 9) oluşturuldu, bu da bu sayfada görüntülenir. Tıklayın ve-sürükle dendrogram üzerinde analiz edilecek ilgi seçme örneklerini vurgulamak için. Hiçbir numune vurgulanmışsa veya hiçbir protein dendrogram oluşturulmuşsa, rasgele bir alt veya tüm numunelerin bir MAN ‘ı saygıyla görünür (Şekil 13). Şekil 13: küçük molekül veri analizi “sayfası. Eğer bir dendrogram protein spektrumunda oluşturulmuşsa, “küçük molekül veri analizi” sayfası içinde görünecektir. Bu sayfa ayrıca küçük molekül verileri için metabolit Ilişkilendirir ağları (MANs) ve Ilke bileşenleri analizi (PCA) görüntüler. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. MAN ‘de boş bir matris/medyayı çıkarmak için, menüyü açın, çıkarmak için bir örnek seçin ve boş olarak kullanmak üzere uygun örneği seçin. Bölüm 9 ‘ da protein spektrumları için yapıldığı gibi, çoğaltır, gürültü sinyali ve üst ve alt kitle kesitlerinde zirve varlığının yüzdesi için istenilen değerleri seçmek üzere Man ayarlarını göster/gizle menüsünü açın. Bu ayarların seçimini yönlendirmek için küçük molekül aynası grafiklerini kullanın. Şu anda görüntülenen MAN verilerini kaydetmek için “geçerli ağ verilerini Indir” seçeneğini belirleyin. Bu veriler, ıdbac dışındaki ağ çözümleme yazılımında kullanılabilir. Raporlama sonuçları için, Man Analizi paragrafını bildirdiği Için öneriler içindeki metni kopyalayın. Bu, oluşturulan MAN oluşturmak için kullanılan Kullanıcı tanımlı ayarları sağlar. 13. veri paylaşma Her ıdbac “deneme” tek bir SQLite veritabanı olarak kaydedilir. Dönüştürülmüş mzML ham spektrumları, algılanan zirveleri ve örneklerle ilgili tüm Kullanıcı giriş bilgilerini içerir. Bu nedenle, bir ıdbac deneyi paylaşmak için yalnızca denemede aynı ada sahip SQlite dosyasını paylaşabilirsiniz (dosya konumu önceki denemeleri Ile çalışma sayfasında görüntülenir).