Usando o pipeline de código aberto MALDI TOF-MS IDBac para análise de proteína microbiana e dados metabólito especializados

1. preparação da matriz MALDI Prepare 10 mg/ml de MALDI-grade, e/ou ácido α-cyano-4-Hydroxycinnamic recristalizado (CHCA) em solventes da MS-classe: 50% acetonitrila (ACN), 47,5% água (H2O), 2,5% ácido trifluoroacético (TFA). Exemplo: 100 μL de solução = 50 μL de ACN + 47,5 μL H2O + 2,5 ΜL de TFA + 1 mg de CHCA Prepare pelo menos 1 μL de solução matricial por ponto de placa MALDI e vórtice ou proceda até em solução (aproximadamente 5 min de sonicação ou sem sólidos visíveis).Cuidado: o TFA é um ácido forte que deve ser manuseado em uma capa de fumaça química enquanto usa equipamento de proteção pessoal adequado, pois pode danificar a pele, os olhos e as vias aéreas com contato ou inalação.Nota: CHCA é higroscópico e sensível à luz e deve ser armazenado em frascos de âmbar em um dessecador. Existem muitas opções de matriz MALDI disponíveis. CHCA é mais comum para o perfil de proteínas de bactérias, mas também funciona para análise de metabolito especializado. A seleção de matrizes depende das necessidades individuais do usuário/experimento. 2. preparação de placas alvo MALDI Nota: Veja Sauer et al.7, para mais detalhes. Enxague a placa MALDI com metanol (HPLC-grade ou superior) e seque com lenços de papel macios. Não use escovas abrasivas ao limpar as placas alvo, pois isso pode danificar permanentemente a superfície da placa alvo. Atribua pontos de calibração de proteínas e metabólito especializados. Organize pontos de calibração uniformemente em toda a população da amostra, para ter em conta a MALDI-Plate-irregularidades e a deriva do instrumento ao longo do tempo. Atribua um número apropriado de pontos de mídia/matriz-em branco para o estudo; esses pontos conterá apenas mídia e matriz, ou apenas matriz. Usando um palito de dente estéril, transfira uma pequena porção de uma colônia bacteriana para o local apropriado na placa MALDI. Espalhe a colônia bacteriana uniformemente sobre o local. O local deve aparecer o mais plano possível.Nota: será mais fácil aplainar colônias bacterianas que são mais Mucoid/amorfos. Para colônias mais rígidas/sólidas, Evite deixar aglomerados visíveis de massa celular no ponto MALDI (Figura 1). Figura 1: placa MALDI-alvo mostrando dois isolados diferentes antes da adição de ácido fórmico e matriz de MALDI (Top 3 spots- Bacillus SP.; fundo 3 manchas- Streptomyces SP.). Para ambos, a coluna 3 representa o excesso de amostra; coluna 2 representa a quantidade apropriada de amostra; coluna 1 representa amostra insuficiente para análise de MALDI. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Prepare uma matriz/controle de mídia usando um palito estéril para transferir uma quantidade mínima de agar/mídia para o local apropriado (s) na placa MALDI. Sobrepor 1 μL de ácido fórmico de grau de espectrometria de massa de 70% em cada ponto da amostra, incluindo os pontos de controle matricial. Deixe o ácido secar completamente em uma capa de fumaça química (aproximadamente 5 min).PRECAUÇÃO: o ácido fórmico é um produto químico cáustico e deve ser manuseado em capas de fumos químicos. Pode danificar as vias respiratórias se inalado. Adicione 1 μL da solução de matriz MALDI preparada para cada ponto da amostra, bem como para os pontos de controle de matriz/mídia. Permita a solução da matriz ao ar secar completamente (aproximadamente 5 minutos).Nota: é possível armazenar a placa em um dessecador, no escuro, até que possa ser analisado em um espectrómetro de massa MALDI-TOF. Os tempos de armazenamento permitidos podem variar dependendo da estabilidade da amostra. Adicione 0,5 – 1,0 μL de calibrante aos pontos de calibração atribuídos, seguidos de 1 μL de solução matricial MALDI. Pipeta a solução resultante para cima e para baixo para misturar. Permitir que todos os pontos de ar secar completamente antes da introdução no Espectrómetro de massa MALDI-TOF.Nota: a proteína e os calibrantes metabólito especializados devem ser adicionados dentro de 30 min da análise de MALDI, pois ambos são suscetíveis à degradação. 3. aquisição de dados Nota: os parâmetros gerais para aquisição de dados estão listados na tabela 1. Parâmetro Proteína Metabólito especializado Início maciço (da) 1920 60 Massa final (da) 21000 2700 Deflexão maciça (da) 1900 50 Tiros 500 1000 Frequência (Hz) 2000 2000 Tamanho do laser Grande Médio MaxStdDev (ppm) 300 30 Tabela 1. Seguindo os protocolos específicos ao instrumento que está sendo usado, ajuste acima as calibrações proteínas e especializadas do metabolito. Teste alguns pontos de destino separados para determinar a potência ideal do laser e o ganho do detector para usar ao adquirir espectros (isso irá variar dia-a-dia e por instrumento).Nota: a figura 2a e a Figura 3a mostram espectros ideais, enquanto a Figura 2D e a Figura 3D são exemplos de espectros de baixa qualidade. Figura 2: Exemplo de espectros proteicos que exibem o efeito de modificar a potência do laser e o ganho do detector. A qualidade dos espectros é melhor no painel A, e diminui até Aqualidade insuficiente dos espectros nos painéis C e D. Embora o espectro no painel B possa resultar em picos utilizáveis, o painel a exibe os dados ideais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Espectros especializados do metabolito do exemplo que indicam o efeito de modificar o poder do laser e o ganho do detector. A qualidade dos espectros é melhor no painel A e diminui até A qualidade insuficiente dos espectros nos painéis C e D. Embora o espectro no painel B possa resultar em picos utilizáveis, o painel a exibe os dados ideais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Adquira espectros, salvando espectros proteicos em uma pasta e espectros metabólito especializados em uma segunda pasta separada. 4. limpeza da placa alvo MALDI (adaptada de Sauer et al.7) Retire a placa alvo MALDI do seu suporte e enxague com acetona. Lave com um sabão líquido não abrasivo para remover proteínas de traço e lipídios, e lenços de papel macios/escova de dentes de cerdas macias. Enxágüe com água de-ionizada por aproximadamente 2 min para remover completamente o sabão. SONICATE a placa alvo em água (HPLC grau ou superior) para 5 min. Enxague a placa alvo com água (grau de HPLC ou superior). Enxague a placa alvo com metanol (grau de HPLC ou superior). 5. instalando o software IDBac Baixe o software IDBac.Nota: os backups permanentes e com controle de versão também estão disponíveis para download (consulte a tabela de materiais). Clique duas vezes no download “Install_IDBac. exe” para iniciar o instalador e siga as instruções na tela. 6. começando com dados brutos Nota: explicações detalhadas e instruções de cada etapa de processamento de dados são incorporadas no IDBac, no entanto, as principais análises e entradas interativas são descritas abaixo. Clique duas vezes no atalho da área de trabalho IDBac para iniciar o IDBac. IDBac será aberto na guia introdução por padrão. Use o botão verificar atualizações para garantir que a versão mais atual do idbac esteja sendo usada (requer acesso à Internet). Se uma versão mais recente estiver disponível, o IDBac fará o download e instalará automaticamente a atualização, após o qual o IDBac solicitará a reiniciada. Clique na guia iniciando com dados brutos e escolha no menu o tipo de dados a serem usados com idbac; continuar seguindo as instruções no aplicativo. Ao configurar a conversão e o processamento de arquivos de dados, insira um nome descritivo para o experimento onde solicitado (consulte a Figura 4). Posteriormente, as experiências serão exibidas em ordem alfabética, portanto, uma estratégia útil é iniciar os nomes dos experimentos com um atributo de grupo (por exemplo, “Bacillus-trials_experiment-1”; “Bacillus-trials_experiment-2”). Figura 4: conversão de dados IDBac e etapa de pré-processamento. O IDBac converte espectros brutos no formato mzML aberto e armazena mzML, listas de pico e informações de amostra em um banco de dados para cada experimento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 7. trabalhe com experimentos anteriores Depois de converter arquivos e processá-los com IDBac, ou a qualquer momento um deseja reanalisar uma experiência, navegue até a página trabalhar com experimentos anteriores e Selecione um experimento para trabalhar (Figura 5). Figura 5: página “trabalhar com experimentos anteriores”. Use a página “trabalhar com experimentos anteriores” do IDBac para selecionar um experimento para analisar ou modificar. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Opcional Adicione informações sobre amostras usando o menu clique aqui para modificar o experimento selecionado. Insira as informações na planilha preenchida automaticamente e pressione Save (Figura 6). Esta opção permite ao usuário dados de código de cores durante as análises. Figura 6: informações de exemplo de entrada. Dentro da página “trabalhar com experimentos anteriores”, os usuários podem inserir informações sobre amostras como identidade taxonômica, localização de coleta, condições de isolamento, etc. clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Opcional Transfira todos ou um subconjunto de amostras para um experimento novo ou outro clicando em transferir amostras de experimentos anteriores para novos/outros experimentos e seguindo as instruções fornecidas (Figura 7). Figura 7: transferir dados. A página “trabalhar com experimentos anteriores” contém a opção de transferir dados entre experimentos existentes e novos experimentos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Quando estiver pronto para começar a análise, assegure-se de que o experimento funcione com está selecionado. Selecione análise de dados de proteínas ou análise de dados de pequenas moléculas. 8. Configurando a análise de dados proteicos e criando parcelas espelhadas Se analisar dados de proteínas, primeiro navegue para a página de análise de dados de proteínas . Escolha as configurações de pico-picking e avalie os espectros proteicos das amostras através das parcelas espelhadas exibidas (Figura 8).Nota: nas parcelas do espelho, um pico vermelho significa a presença desse pico somente no espectro superior, quando os picos azuis representarem aqueles que ocorrem em ambos os espectros. Figura 8: escolha como os picos são retidos para análise. Depois de selecionar um experimento para analisar, visitando a página “análise de dados de proteínas” e, subsequentemente, abrindo o menu “escolher como os picos são retidos para análise” permite que os usuários escolham configurações como a relação sinal-ruído para reter picos. A plotagem espelhada exibida (ou dendrograma) será atualizada automaticamente para refletir as configurações escolhidas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Ajustar o percentual de repetições em que um pico deve estar presente para que ele seja incluído para análises (por exemplo, se o limiar é definido para 70% e um pico ocorre em pelo menos 7 de 10 repetições, ele será incluído). Usando as parcelas espelhadas como orientação Visual, ajuste o sinal para o corte de ruído que retém os picos mais “genuínos” e o mínimo de ruído, observando que mais repetições e um valor maior “presença de pico percentual” permitirá a seleção de um sinal mais baixo para o corte de ruído. Especifique os pontos de corte m/z inferiores e superiores, ditendo o intervalo de valores de massa dentro de cada espectro a ser usado em análises adicionais por idbac. 9. agrupamento de amostras utilizando dados proteicos Dentro da página de análise de dados de proteínas , selecione a guia dendrogram . Isso permite agrupar amostras em um dendrograma de acordo com as medidas de distância selecionadas pelo usuário e os algoritmos de clustering. Clique em selecionar amostras no menu e siga as instruções para selecionar amostras a serem incluídos nas análises. Somente amostras que contenham espectros proteicos serão exibidas dentro da caixa amostras disponíveis (Figura 9). Figura 9: selecione amostras do experimento escolhido para incluir dentro do dendrograma exibido. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Use os valores padrão ou, em escolher configurações de clustering, selecione os algoritmos de distância e clustering desejados a serem aplicados à geração do dendrograma. Selecione presença/ausência como entrada. Alternativamente, se confiante sobre as alturas máximas das amostras (por exemplo, depois de realizar um estudo para avaliar a variabilidade da intensidade de pico), selecione intensidades como entrada.Nota: no momento da publicação, o IDBac fornece flexibilidade nas configurações de clustering, confiando nos usuários para escolher as combinações apropriadas. Se não estiver familiarizado com essas opções, é sugerido para emparelhar a: distância “cosseno” e “média (UPGMA)” clustering; ou B: distância “euclidiana” e “Ward. D2” clustering. Para exibir valores de Bootstrap no dendrogram, insira um número entre 2 e 1000 em bootstraps. Ao relatar resultados, copie o texto dentro das sugestões de relatório de análise de proteínas parágrafo. Isso fornece as configurações definidas pelo usuário que gerou o dendrograma específico. 10. Personalizando o dendrograma da proteína Para começar a personalizar o dendrograma, abra o menu ajustar o dendrograma (Figura 10). Figura 10: Ajuste o dendrograma. IDBac fornece algumas opções para modificar como o dendrograma parece, estes podem ser encontrados dentro do menu “ajustar o dendrograma”. Isso inclui galhos e rótulos de coloração por k-Means, ou “cortando” o dendrograma em uma altura fornecida pelo usuário. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Para colorir as linhas e/ou rótulos do dendrograma, selecione o botão apropriado: clique para modificar linhas ou clique para modificar rótulos e selecione as opções desejadas. Para plotar informações da planilha ao lado do dendrograma (consulte a etapa 7,2), selecione o botão incorporar informações sobre amostras. Isso abrirá um painel onde uma categoria (coluna na planilha) será preenchida automaticamente com base nos valores inseridos (Figura 11). Figura 11: incorporar informações sobre amostras. Dentro do menu “ajustar o dendrograma” é a opção “incorporar informações sobre amostras”. Selecionando isso permitirá plotar informações sobre amostras ao lado do dendrograma. Informações de exemplo são entradas dentro da página “trabalhar com experimentos anteriores”. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 11. Inserir amostras de um experimento separado no dendrograma Para inserir amostras de outro experimento, selecione o botão de menu Inserir amostras de outro experimento. Siga as instruções no painel recém-aberto (Figura 12). Figura 12: inserir amostras no menu outro experimento. Às vezes, é útil comparar amostras de outro experimento. Use o menu “inserir amostras de outro experimento” para escolher amostras a serem incluídos no dendrograma exibido no momento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 12. analisar dados especializados de metabolito e redes de associação de metabolito (MANs) Prossiga para a página da rede de associação metabolito (molécula pequena) . Esta página permite a visualização de dados por análise de componentes principais (PCA) e Mans, que utilizam redes bipartido para exibir a correlação de valores de pequena molécula m/z com amostras. Se um dendrograma de proteína foi criado (seção 9), ele será exibido nesta página também. Clique e arraste no dendrograma para destacar amostras seleto de interesse a serem analisados. Se nenhuma amostra for destacada ou nenhum dendrograma de proteína foi criado, um homem de um subconjunto aleatório ou todas as amostras aparecerá, respeitosamente (Figura 13). Figura 13: pequena molécula de análise de dados “página. Se um dendrograma foi criado a partir de espectros proteicos, ele será exibido dentro da página “Small molécula Data Analysis”. Esta página também exibirá metabolite Associate Networks (MANs) e análise de componentes de princípio (PCA) para dados de pequenas moléculas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Para subtrair uma matriz/mídia em branco no MAN, abra o menu Selecione um exemplo para subtrair e escolha o exemplo apropriado para usar como um espaço em branco. Abra o menu Mostrar/ocultar configurações do Man para selecionar os valores desejados para a porcentagem de presença de pico em repetições, sinal para ruído e cortes de massa superiores e inferiores, como foi feito para espectros proteicos na seção 9. Use as parcelas pequenas do espelho da molécula para guiar a seleção destas configurações. Selecione “transferir dados de rede actuais” para guardar os dados do MAN que está actualmente a ser apresentado. Esses dados podem ser usados em softwares de análise de rede que não sejam IDBac. Para relatar resultados, copie o texto dentro das sugestões para o parágrafo de análise de homem de relatório . Isso fornece as configurações definidas pelo usuário usadas para gerar o MAN criado. 13. compartilhando dados Cada IDBac “experimento” é salvo como um único banco de dados SQLite. Ele contém os espectros brutos mzML convertidos, picos detectados e todas as informações de entrada do usuário sobre amostras. Portanto, para compartilhar um experimento IDBac simplesmente compartilhe o arquivo SQlite que tem o mesmo nome que o experimento (o local do arquivo é exibido na página trabalhando com experimentos anteriores ).