미생물 단백질 및 특수 대사 산물 데이터 분석을 위한 오픈 소스 MALDI TOF-MS IDBac 파이프라인 사용

1. MALDI 매트릭스의 준비 MS 등급 용매에서 10 mg /mL MALDI 등급 및 / 또는 재결정 된 α-cyano-4-hydroxycinic 산 (CHCA)을 준비하십시오 : 50 % 아세토니트릴 (ACN), 47.5 % 물 (H2O), 2.5 % 트리플루오로 아세트산 (TFA). 예: 100 μL 솔루션 = 50 μL ACN + 47.5 μL H2O + 2.5 μL TFA + 1 mg CHCA MALDI 플레이트 스팟 및 소용돌이 또는 초음파 처리(약 5분 초음파 처리 또는 눈에 보이는 고체 없음)까지 MALDI 플레이트 스팟 및 소용돌이 당 적어도 1 μL의 매트릭스 용액을 준비합니다.주의: TFA는 접촉이나 흡입으로 피부, 눈 및 기도를 손상시킬 수 있으므로 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 동안 화학 연기 후드에서 처리해야 하는 강한 산입니다.참고: CHCA는 흡습성 및 빛에 민감하며 건조제에 앰버 바이알에 보관해야 합니다. 사용 가능한 많은 MALDI 행렬 옵션이 있습니다. CHCA는 박테리아의 단백질 프로파일링에 가장 흔하지만, 또한 전문화한 대사 산물 분석을 위해 작동합니다. 매트릭스 선택은 개별 사용자/실험 요구에 따라 달라집니다. 2. MALDI 대상 플레이트 의 준비 참고: 자세한 내용은 Sauer 외7을참조하십시오. 메탄올(HPLC 등급 이상)으로 MALDI 플레이트를 헹구고 부드러운 종이 물티슈로 닦아냅니다. 대상 플레이트의 표면을 영구적으로 손상시킬 수 있기 때문에 대상 플레이트를 청소할 때는 연마 브러시를 사용하지 마십시오. 단백질과 특수 대사 산물 교정 반점을 할당합니다. 시간 지남에 따라 MALDI 플레이트 불규칙성 및 계측기 드리프트를 고려하여 샘플 모집단 전체에 걸쳐 교정 지점을 균등하게 구성합니다. 스터디에 적합한 수의 미디어/매트릭스 빈 스팟을 할당합니다. 이러한 스팟에는 미디어 및 행렬또는 행렬만 포함됩니다. 멸균 이쑤시개를 사용하여, MALDI 플레이트의 적절한 자리에 세균 성 콜로니의 작은 부분을 전송합니다. 세균성 식민지를 그 자리에 고르게 펴발라. 스팟은 가능한 한 평평하게 나타납니다.참고 : 더 점막 / 무정형 인 세균 성 식민지를 평평하게하는 것이 더 쉬울 것입니다. 더 단단하고 단단한 콜로니의 경우 MALDI 스팟에 눈에 보이는셀 덩어리를 남기지 마십시오(그림 1). 그림 1: 포름산 및 MALDI 매트릭스를 추가하기 전에 두 개의 상이한 분리를 나타내는 MALDI-표적 플레이트(상위 3개 지점 – 바실러스 sp.; 하단 3개 반점 – 연쇄상 구균 sp.). 둘 다에 대해 열 3은 초과 샘플을 나타냅니다. 열 2는 적절한 양의 샘플을 나타냅니다. 열 1은 MALDI 분석에 대한 샘플이 부족합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 멸균 이쑤시개를 사용하여 MALDI 플레이트의 적절한 지점에 최소한의 한천/미디어를 전송하여 매트릭스/미디어 제어를 준비합니다. 매트릭스 제어 스팟을 포함하여 각 샘플 스팟에 70% 질량 분석 등급 포매산을 1 μL 오버레이합니다. 화학 연기 후드 (약 5 분)에서 산을 완전히 건조시키십시오.주의: 포름산은 부식성 화학물질이며 화학 연기 후드에서 취급해야 합니다. 흡입하면 기도가 손상될 수 있습니다. 준비된 MALDI 매트릭스 솔루션의 1 μL을 각 샘플 스팟과 매트릭스/미디어 제어 스팟에 추가합니다. 매트릭스 용액이 완전히 건조되도록 하십시오(약 5분).참고 : MALDI-TOF 질량 분석기에서 분석 할 수있을 때까지 어둠 속에서 건조기에 플레이트를 저장할 수 있습니다. 허용 보관 시간은 샘플 안정성에 따라 달라질 수 있습니다. 지정된 교정 지점에 0.5-1.0 μL 교정제를 추가한 다음 1 μL MALDI 매트릭스 솔루션을 추가합니다. 결과 용액을 위아래로 파이펫하여 혼합합니다. MALDI-TOF 질량 분석기로 도입하기 전에 모든 반점이 완전히 건조되도록 하십시오.참고: 단백질과 특수 대사산물 교정란트는 MALDI 분석의 30분 이내에 첨가되어야 하며, 둘 다 열화되기 쉽습니다. 3. 데이터 수집 참고: 데이터 수집에 대한 일반적인 매개 변수는 표1에 나열되어 있습니다. 매개 변수 단백질 전문 대사 산물 매스 스타트(다) 1920년 60 매스 엔드 (다) 21000년 2700년 매스 편향(다) 1900년 50개 촬영 500개 1000년 주파수(Hz) 2000년 2000년 레이저 크기 큰 매체 맥스스테드데브 (ppm) 300개 30개 표 1. 사용되는 기기에 특정한 프로토콜에 따라 단백질 과 특수 대사 산물 교정을 모두 설정합니다. 몇 가지 개별 대상 스팟을 테스트하여 스펙트럼을 획득할 때 사용할 최적의 레이저 전력 및 검출기 게인을 결정합니다(이는 일상적인 및 기기에 따라 다릅니다).참고: 그림 2A 및 그림 3A는 최적의 스펙트럼을 보여 주며 그림 2D 및 그림 3D는 품질이 좋지 않은 스펙트럼의 예입니다. 그림 2: 레이저 전력 및 검출기 게인을 수정하는 효과를 나타내는 단백질 스펙트럼을 예로 들 수 있습니다. 스펙트럼 품질은 패널 A에서가장 적합하며 패널 C 및 D에서스펙트럼 품질이 부족할 때까지 감소합니다. 패널 B의 스펙트럼으로 인해 사용 가능한 피크가 발생할 수 있지만 패널 A는 최적의 데이터를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3: 레이저 전력 및 검출기 게인을 수정하는 효과를 나타내는 특수 대사 산물 스펙트럼을 예로 들 수 있습니다. 스펙트럼 품질은 패널 A에서 가장 적합하며 패널 C 및 D에서스펙트럼 품질이 부족할 때까지 감소합니다. 패널 B의 스펙트럼으로 인해 사용 가능한 피크가 발생할 수 있지만 패널 A는 최적의 데이터를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 스펙트럼을 획득하여 단백질 스펙트럼을 하나의 폴더에 저장하고 특수 대사 산물 스펙트럼을 두 번째 별도의 폴더로 저장합니다. 4. MALDI 대상 플레이트 청소 (Sauer 외7에서 적응) 홀더에서 MALDI 타겟 플레이트를 제거하고 아세톤으로 헹구어 보입니다. 미량 단백질과 지질을 제거하기 위해 비연마액 비누로 씻고 부드러운 종이 물티슈/부드러운 칫솔을 제거합니다. 탈이온수로 약 2분 간 헹구어 비누를 완전히 제거합니다. 대상 플레이트를 물(HPLC 등급 이상)에서 5분 동안 초음파 처리합니다. 대상 플레이트를 물(HPLC 등급 이상)으로 헹구어 보시고 있습니다. 대상 플레이트를 메탄올(HPLC 등급 이상)으로 헹구고 있습니다. 5. IDBac 소프트웨어 설치 IDBac 소프트웨어를 다운로드합니다.참고: 영구 적이 고 버전이 있는 백업도 다운로드할 수 있습니다(자료 표참조). 다운로드한 “Install_IDBac.exe”를 두 번 클릭하여 설치 프로그램을 시작하고 화면의 지침을 따릅니다. 6. 원시 데이터로 시작 참고: 각 데이터 처리 단계에 대한 자세한 설명과 지침은 IDBac에 포함되어 있지만 주요 분석 및 대화형 입력은 아래에 설명되어 있습니다. IDBac 바로 가기를 두 번 클릭하여 IDBac를 시작합니다. IDBac은 기본적으로 소개 탭에서 열립니다. 업데이트 확인 단추를 사용하여 최신 버전의 IDBac가 사용되고 있는지 확인합니다(인터넷 액세스 필요). 최신 버전을 사용할 수 있는 경우 IDBac은 자동으로 업데이트를 다운로드하여 설치한 후 IDBac을 다시 시작하도록 요청합니다. 원시 데이터 로 시작 탭을 클릭하고 메뉴에서 IDBac와 함께 사용할 데이터 유형을 선택합니다. 인앱 지침에 따라 계속합니다. 데이터 파일의 변환 및 처리를 설정할 때 프롬프트가 있는 실험에 대한 설명이름을 입력합니다(그림 4참조). 실험은 나중에 사전순으로 표시되므로 유용한 전략은 그룹 속성(예: “간균 시험_실험-1”)으로 실험 이름을 시작하는 것입니다. “간균 시험_실험-2”). 그림 4: IDBac 데이터 변환 및 전처리 단계. IDBac은 원시 스펙트럼을 개방형 mzML 형식으로 변환하고 각 실험에 대한 데이터베이스에 mzML, 피크 목록 및 샘플 정보를 저장합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 7. 이전 실험작업 파일을 변환하고 IDBac으로 처리한 후 또는 실험을 다시 분석하려는 경우 이전 실험 페이지로 이동하여 작업할 실험을 선택합니다(그림 5). 그림 5: “이전 실험 작업” 페이지. IDBac의 “이전 실험 작업” 페이지를 사용하여 실험을 선택하여 분석하거나 수정할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. (선택 사항) 선택한 실험을 수정하려면 메뉴를사용하여 샘플에 대한 정보를 추가하십시오. 자동 채워진 스프레드시트에 정보를 입력하고 저장을 누릅니다(그림 6). 이 옵션을 사용하면 분석 중에 데이터를 색상 코드화할 수 있습니다. 그림 6: 입력 샘플 정보입니다. “이전 실험 작업” 페이지에서 사용자는 분류학적 ID, 수집 위치, 격리 조건 등과 같은 샘플에 대한 정보를 입력할 수 있습니다. (선택 사항) 이전 실험에서 새/다른 실험으로 샘플 전송을 클릭하고 제공된 지침에 따라 샘플의 전부 또는 하위 집합을 새 실험또는 다른 실험으로 전송합니다(그림 7). 그림 7: 데이터 전송. ‘이전 실험 작업’ 페이지에는 기존 실험과 새 실험 간에 데이터를 전송하는 옵션이 포함되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 분석을 시작할 준비가 되면 작업할 실험이 선택되어 있는지 확인합니다. 단백질 데이터 분석 또는 소분자 데이터 분석을선택합니다. 8. 단백질 데이터 분석 설정 및 거울 플롯 생성 단백질 데이터를 분석하는 경우 먼저 단백질 데이터 분석 페이지로 이동합니다. 피크 피킹 설정을 선택하고 표시된 미러 플롯을 통해 샘플의단백질 스펙트럼을 평가합니다(그림 8).참고: 미러 플롯에서 빨간색 피크는 최상위 스펙트럼에서만 해당 피크의 존재를 나타내고 파란색 피크는 두 스펙트럼모두에서 발생하는 피크를 나타냅니다. 그림 8: 분석을 위해 피크를 보존하는 방법을 선택합니다. 분석할 실험을 선택한 후 “단백질 데이터 분석” 페이지를 방문한 후 “피크가 분석을 위해 유지되는 방법 선택” 메뉴를 열어 사용자는 피크를 유지하기 위한 신호 대 잡음 비율과 같은 설정을 선택할 수 있습니다. 표시된 미러 플롯(또는 덴드로그램)이 선택한 설정을 반영하도록 자동으로 업데이트됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 분석에 포함되기 위해 피크가 있어야 하는 복제물의 백분율을 조정합니다(예: 임계값이 70%로 설정되어 있고 피크가 10개 복제 중 적어도 7개에서 발생하는 경우 포함됩니다). 미러 플롯을 시각적 안내로 사용하여 가장 “정품” 피크와 최소 노이즈를 유지하는 노이즈 차단으로 신호를 조정하여 더 많은 복제와 더 높은 “백분율 피크 존재” 값을 통해 노이즈 차단에 대한 낮은 신호를 선택할 수 있습니다. IDBac의 추가 해석에 사용할 각 스펙트럼 내의 질량 값 범위를 지시하여 하부 및 상위 m/z 컷오프를 지정합니다. 9. 단백질 데이터를 사용하여 샘플을 클러스터링 단백질 데이터 분석 페이지에서 덴드로그램 탭을 선택합니다. 이를 통해 사용자가 선택한 거리 측정 및 클러스터링 알고리즘에 따라 샘플을 덴드로그램으로 그룹화할 수 있습니다. 메뉴에서 샘플 선택을 클릭하고 지침에 따라 분석에 포함할 샘플을 선택합니다. 단백질 스펙트럼을 포함하는 샘플만 사용 가능한 샘플 상자 내에 표시됩니다(그림 9). 그림 9: 표시된 덴드로그램 내에 포함할 선택한 실험에서 샘플을 선택합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 기본값을 사용하거나 클러스터링 설정 선택에서덴드로그램 생성에 적용할 원하는 거리 및 군집 알고리즘을 선택합니다. 현재 상태/부재를 입력으로 선택합니다. 또는 샘플의 피크 높이에 대해 확신하는 경우(예: 피크 강도의 가변성을 평가하기 위한 연구를 수행한 후) 강도를 입력으로 선택합니다.참고: 게시 시 IDBac은 사용자가 적절한 조합을 선택하는 데 의존하여 클러스터링 설정을 유연하게 제공합니다. 이러한 옵션에 익숙하지 않은 경우 A: “코사인” 거리 및 “평균(UPGMA)” 군집 중 하나를 페어링하는 것이 좋습니다. 또는 B: “유클리안” 거리 및 “와드.D2” 군집. 덴드로그램에 부트스트랩 값을 표시하려면 부트스트랩아래에 2에서 1000 사이의 숫자를 입력합니다. 결과를 보고할 때 단백질 분석 보고 제안 단락 내의 텍스트를 복사합니다. 이렇게 하면 특정 덴드로그램을 생성한 사용자 정의 설정이 제공됩니다. 10. 단백질 덴드로그램을 사용자 정의 덴드로그램 사용자 지정을 시작하려면 덴드로그램 조정 메뉴(그림10)를엽니다. 그림 10: 덴드로그램을 조정합니다. IDBac는 덴드로그램의 모양을 수정하기위한 몇 가지 옵션을 제공합니다, 이들은 메뉴 “덴드로 그램 조정”에서 찾을 수 있습니다. 여기에는 k-means에 의한 착색 분기 및 라벨 또는 사용자가 제공한 높이에서 덴드로그램을 “절단”하는 것이 포함됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 덴드로그램의 선 및/또는 라벨에 색상을 지정하려면 적절한 단추를 선택합니다: 선을 수정하려면 클릭하거나 클릭하여 레이블을 수정하고 원하는 옵션을 선택합니다. 덴드로그램 옆에 있는 스프레드시트에서 정보를 플롯하려면(7.2단계 참조) 샘플에 대한 정보 통합 단추를선택합니다. 그러면 범주(스프레드시트의 열)가 입력된 값(그림 11)에 따라자체 채우는 패널이 열립니다. 그림 11: 샘플에 대한 정보를 통합합니다. “Dendrogram 조정” 메뉴에는 “샘플에 대한 정보 통합” 옵션이 있습니다. 이 옵션을 선택하면 덴드로그램 옆에 있는 샘플에 대한 정보를 플로팅할 수 있습니다. 샘플 정보는 “이전 실험 작업” 페이지에 입력됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 11. 별도의 실험에서 샘플을 덴드로그램에 삽입하십시오. 다른 실험에서 샘플을 삽입하려면 다른 실험에서 샘플 삽입메뉴 단추를 선택합니다. 새로 연 패널의 지침을 따릅니다(그림12). 그림 12: 다른 실험 메뉴에서 샘플을 삽입합니다. 때로는 다른 실험의 샘플을 비교하는 것이 유용합니다. “다른 실험에서 샘플 삽입” 메뉴를 사용하여 현재 표시된 덴드로그램 내에 포함할 샘플을 선택합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 12. 전문 대사 산물 데이터 및 대사 산물 협회 네트워크 (MAN) 분석 대사 산물 협회 네트워크 (소분자) 페이지로 이동합니다. 이 페이지에서는 이중 분할 네트워크를 사용하여 샘플과 소분자 m/z 값의 상관 관계를 표시하는 원리 성분 분석(PCA) 및 MAN에 의한 데이터 시각화를 허용합니다. 단백질 덴드로그램이 생성된 경우(섹션 9), 이 페이지에도 표시됩니다. 분석할 관심 있는 샘플을 강조하기 위해 덴드로그램을 클릭하고 드래그합니다. 어떤 견본이 강조되지 않거나 단백질 dendrogram가 생성되지 않은 경우에, 임의의 서브세트 또는 모든견본의 MAN은 정중하게, 나타날 것입니다 (그림 13). 그림 13: 소분자 데이터 분석” 페이지. 덴드로그램이 단백질 스펙트럼에서 생성된 경우, “소분자 데이터 분석” 페이지에 표시됩니다. 이 페이지에는 소분자 데이터에 대한 대사산물 관련 네트워크(MAN) 및 원리 성분 분석(PCA)도 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. MAN에서 매트릭스/미디어 공백을 빼려면 메뉴를 열어 빼기 샘플을 선택하고 공백으로 사용할 적절한 샘플을 선택합니다. 섹션 9의 단백질 스펙트럼에 대해 수행된 것처럼 메뉴 표시/숨기기 MAN 설정을 열어 복제, 노이즈 신호 및 상부 및 하부 질량 차단에서 피크 존재 비율에 대해 원하는 값을 선택합니다. 소분자 미러 플롯을 사용하여 이러한 설정의 선택을 안내합니다. “현재 네트워크 데이터 다운로드”를 선택하여 현재 표시되는 MAN의 데이터를 저장합니다. 이러한 데이터는 IDBac 이외의 네트워크 분석 소프트웨어에 사용할 수 있습니다. 결과를 보고하기 위해 MAN 분석 보고 제안 단락 내의 텍스트를 복사합니다. 이렇게 하면 생성된 MAN을 생성하는 데 사용되는 사용자 정의 설정이 제공됩니다. 13. 데이터 공유 각 IDBac “실험”은 단일 SQLite 데이터베이스로 저장됩니다. 여기에는 변환된 mzML 원시 스펙트럼, 감지된 피크 및 샘플에 대한 모든 사용자 입력 정보가 포함됩니다. 따라서 IDBac 실험을 공유하려면 실험과 이름이 같은 SQlite 파일을 공유하기만 하면 됩니다(파일 위치는 이전 실험 작업 페이지에 표시됩니다).