Met behulp van de open-source MALDI TOF-MS IDBac pijpleiding voor analyse van microbiële eiwitten en gespecialiseerde metaboliet gegevens

1. bereiding van de MALDI-matrix Bereid 10 mg/mL MALDI-grade, en/of herkristalliseerd α-cyano-4-hydroxycinnaminezuur (CHCA) in oplosmiddelen van MS-kwaliteit: 50% acetonitril (ACN), 47,5% water (H2O), 2,5% trifluorazijnzuur (TFA). Voorbeeld: 100 μL oplossing = 50 μL ACN + 47,5 μL H2O + 2,5 ΜL TFA + 1 mg chca Bereid ten minste 1 μL matrix oplossing per MALDI-plaat vlek en Vortex of sonicatie tot in de oplossing (ongeveer 5 minuten ultrasoonapparaat of geen zichtbare vaste stoffen).Let op: TFA is een sterk zuur dat moet worden behandeld in een chemische rook afzuigkap tijdens het dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, omdat het de huid, ogen en luchtwegen kan beschadigen met contact of inademing.Opmerking: CHCA is hygroscopisch en lichtgevoelig en moet worden opgeslagen in Amber flesjes in een exsiccator. Er zijn veel MALDI matrix opties beschikbaar. CHCA is het meest gebruikelijk voor eiwit profilering van bacteriën, maar werkt ook voor gespecialiseerde metaboliet analyse. Matrix selectie is afhankelijk van individuele gebruiker/experiment behoeften. 2. bereiding van de doelplaten van MALDI Opmerking: Zie Sauer et al.7voor meer informatie. Spoel MALDI-plaat met methanol (HPLC-kwaliteit of hoger) en veeg droog met zachte papieren doekjes. Gebruik geen schuurborstels bij het reinigen van doelplaten, omdat dit het oppervlak van de doelplaat blijvend kan beschadigen. Wijs eiwit en gespecialiseerde metaboliet kalibrerende vlekken toe. Organiseer kalibratie spots gelijkmatig over de populatie van het monster, om rekening te kunnen maken met MALDI-plaat-onregelmatigheden en instrument drift na verloop van tijd. Wijs een passend aantal media/matrix-blanco plekken toe voor de studie; deze vlekken zullen alleen media en matrix bevatten, of alleen matrix. Gebruik een steriele tandenstoker en breng een klein gedeelte van een bacterie kolonie over naar de juiste plek op de MALDI-plaat. Verdeel de bacterie kolonie gelijkmatig over de plek. De plek moet zo plat mogelijk worden weergegeven.Opmerking: het zal gemakkelijker zijn om bacteriële kolonies die meer mucoïde/amorf zijn te afvlakken. Voor meer stijve/vaste kolonies, Vermijd het verlaten van zichtbare clusters van celmassa op de MALDI-vlek (Figuur 1). Figuur 1: MALDI-doelplaat die twee verschillende isolaten weergeeft alvorens mierenzuur en MALDI matrix toe te voegen (top 3 spots- Bacillus SP.; onderste 3 spots- Streptomyces SP.). Voor beide, kolom 3 staat voor overtollige steekproef; kolom 2 staat voor de juiste hoeveelheid monster; kolom 1 geeft onvoldoende voorbeeld voor MALDI-analyse. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Bereid een matrix/media-regeling met behulp van een steriele tandenstoker om een minimale hoeveelheid agar/medium over te brengen op de juiste spot (en) op de MALDI-plaat. Overlay 1 μL van 70% massaspectrometrie graad mierenzuur op elke monster vlek, met inbegrip van de matrix controle vlekken. Laat zuur aan de lucht volledig drogen in een chemische rook afzuigkap (ongeveer 5 min).Let op: mierenzuur is een bijtende chemische stof en moet worden behandeld in chemische rook afzuigkappen. Het kan de luchtwegen beschadigen bij inademing. Voeg 1 μL van de bereide MALDI-matrix oplossing toe aan elke sample spot, evenals aan de matrix/Media Control spots. Laat de matrix oplossing volledig drogen (ongeveer 5 min).Opmerking: het is mogelijk om de plaat in een exsiccator te bewaren, in het donker, totdat deze kan worden geanalyseerd op een MALDI-TOF massaspectrometer. Toegestane opslag tijden kunnen variëren afhankelijk van de monster stabiliteit. Voeg 0,5 – 1,0 μL kalibrering toe aan de toegewezen ijkpunten, gevolgd door 1 μL MALDI-matrix oplossing. Pipetteer de resulterende oplossing op en neer om te mengen. Laat alle plekken in de lucht volledig drogen voorafgaand aan de introductie in de MALDI-TOF massaspectrometer.Opmerking: de eiwitten en gespecialiseerde metaboliet kalibranten moeten worden toegevoegd binnen 30 min van MALDI analyse, omdat beide vatbaar zijn voor degradatie. 3. gegevensverzameling Opmerking: de algemene parameters voor het verzamelen van gegevens worden weergegeven in tabel 1. Parameter Eiwit Gespecialiseerde metaboliet Massa start (da) 1920 60 Massa-einde (da) 21000 2700 Massa afbuiging (da) 1900 50 Shots 500 1000 Frequentie (Hz) 2000 2000 Laser grootte Grote Medium MaxStdDev (ppm) 300 30 Tabel 1. Volg de specifieke protocollen voor het gebruikte instrument en stel zowel eiwitten als gespecialiseerde metaboliet kalibraties in. Test enkele afzonderlijke doelpunten om de optimale Laser stroom en detector versterking te bepalen voor gebruik bij het verkrijgen van spectra (dit varieert per dag en per instrument).Opmerking: Figuur 2a en Figuur 3a vertonen optimale spectra, terwijl figuur 2D en figuur 3D voorbeelden zijn van spectra van slechte kwaliteit. Figuur 2: Voorbeeld van proteïne spectra die het effect van het wijzigen van laser vermogen en detector versterking weergeven. Spectra kwaliteit is het beste in paneel A, en verlaagt tot onvoldoende Spectra kwaliteit in panelen C en D. Terwijl het spectrum in paneel B kan resulteren in bruikbare pieken, geeft panel A optimale gegevens weer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 3: Voorbeeld gespecialiseerde metaboliet Spectra tonen het effect van het aanpassen van laser vermogen en detector Gain. De kwaliteit van spectra is het beste in paneel A en neemt af tot de kwaliteit van de spectra in deelvensters C en Donvoldoende is. Terwijl het spectrum in paneel B kan resulteren in bruikbare pieken, geeft panel A optimale gegevens weer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Verkrijg spectra, het opslaan van eiwit spectra in één map en gespecialiseerde metaboliet spectra in een tweede, aparte map. 4. reiniging van de MALDI-doelplaat (aangepast van Sauer et al.7) Verwijder de MALDI-doelplaat uit de houder en spoel met aceton. Wassen met een niet-schurende vloeibare zeep om Trace eiwitten en lipiden te verwijderen, en zachte papieren doekjes/zacht-bristled tandenborstel. Spoel ongeveer 2 minuten met gedeïoniseerd water om de zeep volledig te verwijderen. Sonicate de doelplaat in water (HPLC-kwaliteit of hoger) gedurende 5 minuten. Spoel de doelplaat met water (HPLC-kwaliteit of hoger). Spoel de doelplaat met methanol (HPLC-kwaliteit of hoger). 5. de IDBac software installeren Download de IDBac software.Opmerking: permanente, versiebeheer back-ups zijn ook beschikbaar om te downloaden (Zie de tabel met materialen). Dubbelklik op het gedownloade “Install_IDBac. exe” om het installatieprogramma te starten en volg de instructies op het scherm. 6. beginnen met onbewerkte gegevens Opmerking: gedetailleerde uitleg en instructies van elke gegevensverwerkings stap zijn ingebed in IDBac, maar de belangrijkste analyses en interactieve ingangen worden hieronder beschreven. Dubbelklik op de snelkoppeling op het bureaublad IDBac om IDBac te starten. IDBac wordt standaard geopend op het tabblad Inleiding . Gebruik de knop controleren op updates om ervoor te zorgen dat de meest recente versie van IDBAC wordt gebruikt (internettoegang vereist). Als er een nieuwere versie beschikbaar is, zal IDBac de update automatisch downloaden en installeren, waarna IDBac zal verzoeken om opnieuw te worden opgestart. Klik op het tabblad beginnen met onbewerkte gegevens en kies uit het menu het type gegevens dat moet worden gebruikt met IDBAC; Volg de instructies in de app. Bij het instellen van de conversie en verwerking van gegevensbestanden, voer een beschrijvende naam voor het experiment wanneer hierom wordt gevraagd (Zie afbeelding 4). Experimenten worden later alfabetisch weergegeven, dus een nuttige strategie is om te beginnen met het experiment namen met een groep-kenmerk (bijvoorbeeld “Bacillus-trials_experiment-1”; “Bacillus-trials_experiment-2”). Figuur 4: IDBac gegevensconversie en voor verwerking stap. IDBac converteert RAW Spectra naar het open mzML formaat en slaat mzML, Peak lists en sample informatie op in een database voor elk experiment. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. 7. werken met eerdere experimenten Na het converteren van bestanden en het verwerken ervan met IDBac, of op elk moment dat u een experiment opnieuw wilt analyseren, navigeert u naar de pagina werken met vorige experimenten en selecteert u een experiment om mee te werken (Figuur 5). Afbeelding 5: pagina ‘ werken met eerdere experimenten ‘. Gebruik de pagina ‘ werken met eerdere experimenten ‘ van IDBac om een experiment te selecteren dat u wilt analyseren of wijzigen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Optionele Informatie over voorbeelden toevoegen met het menu Klik hier om het geselecteerde experiment te wijzigen. Voer informatie in het automatisch ingevulde werkblad in en druk op Save (Figuur 6). Met deze optie kan de gebruiker gegevens in kleur coderen tijdens analyses. Afbeelding 6: invoer voorbeeld informatie. In de pagina ‘ werken met eerdere experimenten ‘ kunnen gebruikersinformatie invoeren over samples zoals taxonomische identiteit, ophaallocatie, isolatie voorwaarden, etc. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Optionele Breng alle of een subset van de voorbeelden over naar een nieuw of ander experiment door te klikken op voorbeelden van vorige experimenten overbrengen naar nieuwe/andere experimenten en de instructies te volgen (Figuur 7). Afbeelding 7: gegevens overdragen. De pagina ‘ werken met eerdere experimenten ‘ bevat de optie om gegevens over te brengen tussen bestaande experimenten en nieuwe experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Wanneer klaar om te beginnen met de analyse, zorg ervoor dat het experiment om te werken met is geselecteerd. Selecteer ofwel eiwit gegevensanalyse of kleine molecuul gegevensanalyse. 8. opzetten van eiwit data analyse en creëren van spiegel plots Als u eiwit gegevens analyseert, navigeert u eerst naar de pagina eiwit gegevensanalyse . Kies instellingen voor Peak-picking en evalueer de eiwit spectra van samples via de weergegeven spiegel plots (Figuur 8).Opmerking: in de spiegel plots geeft een rode piek de aanwezigheid van die piek alleen in het bovenste spectrum aan, terwijl blauwe pieken de punten vertegenwoordigen die zich in beide Spectra voordoen. Afbeelding 8: Kies hoe pieken worden bewaard voor analyse. Na het selecteren van een experiment om te analyseren, een bezoek aan de “eiwit Data Analysis” pagina en vervolgens het openen van de “Kies hoe pieken worden bewaard voor analyse” menu stelt gebruikers in staat om instellingen te kiezen, zoals signaal-ruis verhouding voor het behoud van pieken. De weergegeven spiegel plot (of dendrogram) wordt automatisch bijgewerkt om de gekozen instellingen weer te geven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Pas het percentage van de replicaten aan waarin een piek aanwezig moet zijn zodat deze voor analyses kan worden opgenomen (bijvoorbeeld als de drempelwaarde is ingesteld op 70% en een piek voorkomt in ten minste 7 van de 10 replicaten, wordt deze opgenomen). Gebruik de spiegel plots als visuele begeleiding, pas het signaal aan op ruisonderdrukking die de meest “echte” pieken en de minste ruis behoudt, waarbij wordt opgemerkt dat meer replicaten en een hogere waarde “percentage piek aanwezigheid” het mogelijk maakt een lager signaal te kiezen voor ruisonderdrukking. Geef de onderste en bovenste m/z Cutoffs, dicteren van het bereik van de massa-waarden binnen elk spectrum moet worden gebruikt in verdere analyses door IDBAC. 9. clustering monsters met behulp van eiwit gegevens Selecteer op de pagina eiwit gegevensanalyse het tabblad dendrogram . Dit maakt het mogelijk om monsters in een dendrogram te groeperen volgens door de gebruiker geselecteerde afstandsmetingen en clustering algoritmen. Klik op voor beelden selecteren in het menu en volg de instructies om monsters te selecteren die u in de analyses wilt opnemen. Alleen monsters die eiwit Spectra bevatten, worden weergegeven in het vak beschikbare monsters (Figuur 9). Afbeelding 9: Selecteer samples uit het gekozen experiment om op te nemen in het weergegeven dendrogram. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Gebruik de standaardwaarden of Selecteer onder clustering-instellingen kiezende gewenste afstand -en cluster algoritmen die moeten worden toegepast op het genereren van het dendrogram. Selecteer aanwezigheid/afwezigheid als invoer. Als alternatief, als u vertrouwen hebt in de piekhoogten van de monsters (bijvoorbeeld na het uitvoeren van een studie om de variabiliteit van de piek intensiteit te beoordelen), selecteert u intensiteiten als invoer.Opmerking: op het moment van publicatie biedt IDBac flexibiliteit in instellingen voor clustering, afhankelijk van gebruikers om de juiste combinaties te kiezen. Als deze opties niet bekend zijn, wordt voorgesteld om een: “cosinus”-afstand en “gemiddelde (UPGMA)”-clustering te koppelen; of B: “Euclidische” afstand, en “Ward. D2” clustering. Als u bootstrap-waarden wilt weergeven op het dendrogram, voert u een getal in tussen 2 en 1000 onder Boots riemen. Wanneer u resultaten rapporteert, kopieert u de tekst in de suggesties voor rapportage van de eiwitanalyse alinea. Dit biedt de gebruiker gedefinieerde instellingen die het specifieke dendrogram gegenereerd. 10. het eiwit dendrogram aanpassen Om te beginnen met het aanpassen van het dendrogram, opent u het menu dendrogram aanpassen (afbeelding 10). Figuur 10: Stel het dendrogram in. IDBac biedt een aantal opties voor het wijzigen van hoe het dendrogram eruitziet, deze kunnen worden gevonden in het menu “pas het dendrogram”. Dit omvat het kleuren van takken en labels door k-middelen, of door het “snijden” van het dendrogram op een door de gebruiker geleverde hoogte. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Om de lijnen en/of labels van het dendrogram te kleuren, selecteert u de juiste knop: Klik om regels te wijzigen of Klik om labels te wijzigen en selecteer de gewenste opties. Als u informatie uit het werkblad naast het dendrogram wilt uitzetten (zie stap 7,2), selecteert u de knop informatie over voorbeelden opnemen. Hiermee wordt een deelvenster geopend waarin een categorie (kolom in het werkblad) zelf wordt ingevuld op basis van de ingevoerde waarden (afbeelding 11). Afbeelding 11: informatie over samples opnemen. In het “aanpassen van het dendrogram” menu is de optie “Integreer informatie over samples”. Als u dit selecteert, u informatie over voorbeelden naast het dendrogram laten plotten. De voorbeeld informatie wordt ingevoerd in de pagina ‘ werken met eerdere experimenten ‘. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. 11. Steek monsters van een apart experiment in het dendrogram Als u voorbeelden uit een ander experiment wilt invoegen, selecteert u de menuknop voor beelden uit een ander experiment invoegen. Volg de aanwijzingen in het nieuw geopende paneel (afbeelding 12). Afbeelding 12: steek samples uit een ander experiment menu. Soms is het handig om samples van een ander experiment te vergelijken. Gebruik het menu “steek monsters uit een ander experiment” om monsters te kiezen die in het momenteel getoonde dendrogram moeten worden opgenomen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. 12. analyse van gespecialiseerde metaboliet gegevens en metaboliet Association Networks (MANs) Ga naar de metaboliet Association Network (Small-molecule) pagina. Deze pagina maakt het mogelijk voor gegevensvisualisatie door principe componenten Analysis (PCA) en MANs, die bipartiete netwerken gebruiken om de correlatie van kleine molecuul m/z -waarden met monsters weer te geven. Als een eiwit dendrogram is gemaakt (sectie 9), wordt het ook op deze pagina weergegeven. Klik-en-sleep op het dendrogram om geselecteerde monsters van belang te markeren die moeten worden geanalyseerd. Als er geen monsters zijn gemarkeerd of er geen eiwit dendrogram is gemaakt, zal een MAN met een willekeurige subset of alle monsters met respect verschijnen (Figuur 13). Afbeelding 13: kleine molecule Data Analysis “pagina. Als een dendrogram is gemaakt van eiwit spectra, zal het worden weergegeven in de “kleine molecule Data Analysis” pagina. Deze pagina wordt ook weergegeven metaboliet geassocieerde netwerken (MANs) en principe componenten analyse (PCA) voor kleine molecuul gegevens. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Als u een matrix/media leeg wilt maken in de MAN, opent u het menu Selecteer een voorbeeld om af te trekken en kiest u het juiste voorbeeld dat u als blanco wilt gebruiken. Open het menu Toon/VERBERG man instellingen om de gewenste waarden te selecteren voor percentage van piek aanwezigheid in replicaten, signaal naar ruis en boven-en ondermassa Cutoffs, zoals is gedaan voor eiwit spectra in rubriek 9. Gebruik de kleine molecule mirror plots om de selectie van deze instellingen te begeleiden. Selecteer ‘ huidige netwerkgegevens downloaden ‘ om de gegevens op te slaan van de MAN die op dat moment wordt weergegeven. Deze gegevens kunnen worden gebruikt in andere netwerk analyse software dan IDBac. Voor het rapporteren van resultaten kopieert u de tekst in de suggesties voor rapportage van man-analyse alinea. Dit biedt de gebruiker gedefinieerde instellingen gebruikt voor het genereren van de gemaakte MAN. 13. gegevens delen Elke IDBac “experiment” wordt opgeslagen als een enkele SQLite-database. Het bevat de geconverteerde mzML RAW spectra, gedetecteerde pieken en alle input informatie van de gebruiker over samples. Om een IDBac-experiment te delen, deelt u daarom gewoon het SQlite-bestand met dezelfde naam als het experiment (de bestandslocatie wordt weergegeven op de pagina werken met vorige experimenten ).