Verbeterde gist One-hybride schermen te identificeren van de transcriptiefactor binden aan menselijke DNA-sequenties
Summary
Hier presenteren we een verbeterde gist één-hybrid screening protocol ter identificatie van de transcriptiefactoren (TFs) die zich aan een menselijke DNA-regio van belang binden kunnen. Deze methode maakt gebruik van een high-throughput screening-pijpleiding die de binding van ondervragen kan > 1000 TFs in een enkele experiment.
Abstract
Het identificeren van de sets van transcriptiefactoren (TFs) die regelen van elk menselijk gen is een enorme taak die vereist integratie van talrijke experimentele en computationele benaderingen. Een dergelijke methode is de gist één-hybride (Y1H) assay, in welke interacties tussen TFs en DNA regio’s worden getest in de omgeving van de kern van de gist met behulp van verslaggever genen. Y1H tests omvatten twee componenten: een ‘DNA-aas’ (b.v.., initiatiefnemers, versterkers, geluiddempers, etc.) en een ‘TF-prooi,”die kan worden gescreend voor reporter gene activering. Meest gepubliceerde protocollen voor het uitvoeren van Y1H schermen zijn gebaseerd op het omzetten van TF-prooi bibliotheken of arrays in DNA-aas giststammen. Hier beschrijven we een pijpleiding, verbeterde Y1H genoemd (eY1H) testen, waar TF-DNA interacties zijn ondervraagd door de paring van de DNA-aas stammen met een gekleed verzameling TF-prooi stammen met behulp van een array met hoge dichtheid (HDA) robotic platform waarmee screening in een 1,536 de indeling van de kolonie. Dit zorgt voor een dramatische toename van de doorvoer (60 opeenvolgingen van DNA-aas tegen > 1.000 TFs duurt twee weken per onderzoeker) en reproduceerbaarheid. We illustreren de verschillende soorten van de verwachte resultaten door het testen van sequenties van menselijke promotor tegen een array van 1,086 menselijke TFs, evenals voorbeelden van problemen die zich kunnen voordoen tijdens de schermen en het oplossen van hen.
Introduction
Een centraal probleem op het gebied van biomedische is het bepalen van de mechanismen waarmee elk menselijk gen wordt geregeld. Transcriptie is de eerste stap bij het beheersen van gen expressie niveaus, en het is geregeld door sets van transcriptiefactoren (TFs) die uniek voor elk gen zijn. Gezien het feit dat mensen coderen voor > 1500 TFs1,2, identificatie van de complete set van TFs waarmee de expressie van elk gen blijft een open uitdaging.
Twee soorten methoden kunnen worden gebruikt voor het toewijzen van TF-DNA interacties: TF-gecentreerd en DNA-gecentreerd methode3 (figuur 1A). TF-gecentreerde methoden, is een TF van belang voor de binding aan de genomic DNA regio’s of om te bepalen zijn DNA-bindende specificiteit gesondeerd. Deze methoden omvatten chromatine immunoprecipitation (ChIP), gevolgd door sequentiebepaling van high-throughput, eiwit bindende microarrays en SELEX4,5,6. In DNA-gecentreerde methoden, is een opeenvolging van DNA van belang om te bepalen van de set van TFs die zich aan het DNA-sequentie binden gesondeerd. De meest toegepaste van dergelijke methoden is gist één-hybride (Y1H) testen, in welke interacties tussen TFs en DNA regio’s worden getest in de omgeving van de kern van de gist met reporter genen7,8,9.
Y1H tests omvatten twee componenten: een ‘DNA-aas’ (bijv. de initiatiefnemers, versterkers, geluiddempers, etc.) en een ‘TF-prooi,”die kan worden gescreend voor reporter gene activering9,10 (figuur 1B). Het DNA-aas wordt gekloond stroomopwaarts van twee reporter genen (LacZ en HIS3) en beide DNA-bait::reporter constructies zijn geïntegreerd in het genoom van de gist voor het genereren van chromatinized ‘DNA-aas stammen.’ De TF-prooi, gecodeerd in een plasmide die een TF gesmolten tot het domein (AD) van de activering van de gist Gal4 TF uitdrukt, is ingevoerd in de stam van de DNA-aas te vissen voor TF-DNA interacties. Als de TF-prooi aan de opeenvolging van DNA-aas bindt, dan is de advertentie aanwezig in de TF-prooi zal leiden tot de activering van beide genen verslaggever. Dientengevolge, kunnen cellen met een positieve interactie worden geselecteerd voor groei op platen histidine ontbreekt, evenals het overwinnen van een concurrerende inhibitor, 3-Amino-1,2,4-triazool (3-AT), en gevisualiseerd als blauwe kolonies in aanwezigheid van X-gal. Omdat de potente gist Gal4 AD wordt gebruikt, Y1H assays interacties transcriptionele activators evenals repressors kunnen detecteren. Bovendien, gezien het feit dat de TF-prooien worden uitgedrukt van een sterke gist promotor (ADH1), kunnen interacties worden gedetecteerd zelfs voor TFs die lage endogene expressie niveaus, die zijn uitdagend hebben te detecteren door ChIP11,12.
Meest gepubliceerde protocollen voor het uitvoeren van Y1H assays zijn gebaseerd op de invoering van TF-prooien in de DNA-aas giststammen door transformeren gepoolde TF-prooi bibliotheken gevolgd door selectie, kolonie plukken en rangschikken om te identificeren van de interactie TF, of door transformatie van individuele klonen8,9. Dit zijn tijdrovende protocollen, beperking van het aantal DNA-sequenties die kunnen worden getest per onderzoeker. Een recente verbetering van Y1H tests, genaamd versterkt Y1H (eY1H), is sterk toegenomen de screening doorvoer met behulp van een hoge dichtheid matrix (HDA) robotic platform om te paren giststammen DNA-aas met een collectie giststammen elk uiting geven aan een ander TF-prooi10,13 (Figuur 1 c). Deze schermen gebruiken een 1.536 kolonie formaat waardoor voor het testen van de meeste menselijke TFs in viervoud met behulp van slechts drie platen. Verder, gezien het feit dat de TF-DNA interacties worden getest in een paarsgewijze manier, deze aanpak maakt het mogelijk voor het vergelijken van interacties tussen DNA-aas (zoals twee noncoding één nucleotide varianten) en tussen verschillende TFs of TF varianten11,12 ,14.
Met behulp van eY1H assays, hebben we de grootste mens en Caenorhabditis elegans DNA-gecentreerde TF-DNA interacties netwerken tot heden afgebakend. In het bijzonder, hebben we 2,230 interacties tussen 246 menselijke developmental smaakversterkers en 283 TFs12vastgesteld. Verder hebben we gebruikt eY1H testen om te ontdekken van gewijzigde TF binding aan 109 één nucleotide noncoding varianten die zijn gekoppeld aan genetische ziekten zoals ontwikkelingsstoornissen malformatie, kanker en neurologische aandoeningen. Meer recentelijk hebben we gebruikt eY1H om af te bakenen een netwerk bestaande uit 21,714 interacties tussen 2.576 C. elegans gene initiatiefnemers en 366 TFs11. Dit netwerk was behulpzaam om te ontdekken de functionele rol van tientallen C. elegans TFs.
De protocollen voor het genereren van DNA-aas vlekken en evalueren van de niveaus van achtergrond verslaggever activiteit geweest gemeld elders15,16,17. Hier beschrijven we een pijpleiding van de eY1H die kan worden gebruikt om het scherm van een menselijke genomic DNA regio tegen een array van 1,086 menselijke TFs. Zodra een gist stam van de DNA-aas wordt gegenereerd en een TF-prooi-matrix is bevlekt op de overeenkomstige platen, kan het gehele protocol worden uitgevoerd in twee weken (tabel 1). Wat nog belangrijker is, kan het protocol worden heeft zodat een enkele onderzoeker kan scherm 60 opeenvolgingen van DNA-aas gelijktijdig. We gescreend om aan te tonen van het protocol, de initiatiefnemers van de twee genen van cytokine CCL15 en IL17F. Daarnaast tonen we de resultaten van mislukte schermen ter illustratie van de soorten problemen die zich voordoen kunnen bij het uitvoeren van eY1H testen en het oplossen van hen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De robotic eY1H paring screening beschreven aanpak hier sterk verhoogt de doorvoer ter identificatie van de set van TFs die zich aan een DNA-regio van belang binden, in vergelijking met vorige bibliotheek screening of gekleed screening benaderingen gebaseerd op transformatie. Verder, de TF-DNA-interacties die zijn gedetecteerd door eY1H testen zeer reproduceerbaar, zijn 90% van interacties genotypes zijn positief voor alle vier kolonies per TF getest, en 90% van interacties opnieuw testen in een onafhankelijke scherm van…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health [R35-GM128625 naar J.I.F.B.].
Materials
| 3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC | Sigma | A8056-100G | Competitive inhibitor for products of HIS3 gene |
| Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate | US Biologicals | A0865 | Required for proper yeast growth |
| Agar High Gel Strength – Bacteriological grade | American International Chemical | AGHGUP | Nutritive media for yeast growth |
| Ammonium Sulfate | US Biologicals | A1450 | Nitrogen source in synthetic yeast media |
| D+ Glucose Anhydrous | US Biologicals | G3050 | Required for yeast growth |
| Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base | US Biologicals | D9540-02 | Synthetic complete media required for yeast growth |
| edge Multiparameter pH Meter | Hanna Instruments | HI2020-01 | To measure pH of selective media |
| Flat Toothpicks 750ct | Diamond | To streak yeasts on petridishes | |
| Glass Beads | Walter Stern | 100C | To spreak yeast when making lawns |
| Glycerol ≥99% | Millipore Sigma | G9012-1L | Required to make frozen yeast stocks |
| L-Histidine | US Biologicals | H5100 | For yeast growth selection in selective media |
| L-Leucine | US Biologicals | L2020-05 | For yeast growth selection in selective media |
| L-Tryptophan | Sigma | T-0254 | For yeast growth selection in selective media |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | 319937-1L | To make X-gal solution |
| Omnipense Elite | Wheaton | W375030-A | For dispensing accurate volumes of media into Singer plates |
| Peptone, Bacteriological | American International Chemical | PEBAUP | Protein source required for yeast growth |
| Petri Dish, 150×15 mm | VWR | 10753-950 | For growing yeast baits for screening |
| PlusPlates | Singer Instruments | PLU-003 | To make rectangular agar plates to use with Singer Robot |
| Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator | ThermoFisher Scientific | PR205745R | To incubate yeast plates at constant temperature |
| RePads 1,536 short | Singer Instruments | REP-005 | To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates |
| RePads 384 short | Singer Instruments | REP-004 | To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format |
| RePads 96 long | Singer Instruments | REP-001 | To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate |
| RePads 96 short | Singer Instruments | REP-002 | To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format |
| Singer HDA RoToR robot | Singer Instruments | For transfering yeast in high-throughput manner | |
| Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) | Fisher | S318-1 | For adjusting pH of selective media |
| Sodium Phosphate dibasic heptahydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-203402C | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
| Sodium Phosphate monobasic monohydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-202342B | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | For yeast growth selection in selective media |
| X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) | Gold Biotechnology | X4281C100 | β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction |
| Yeast Extract | US Biologicals | Y2010 | Nutritious medium for growth and propagation of yeast |
| Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS | US Biologicals | Y2030 | Required for vigorous yeast growth |
Riferimenti
- Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).
- Lambert, S. A., et al. The Human Transcription Factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
- Arda, H. E., Walhout, A. J. Gene-centered regulatory networks. Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).
- Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).
- Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays. Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
- Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system. Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).
- Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System. Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Reece-Hoyes, J. S., et al. Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).
- Fuxman Bass, J. I., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions. Molecular Systems Biology. 12 (10), 884 (2016).
- Fuxman Bass, J. I., et al. Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants. Cell. 161 (3), 661-673 (2015).
- Reece-Hoyes, J. S., et al. Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).
- Sahni, N., et al. Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders. Cell. 161 (3), 647-660 (2015).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Deplancke, B., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network. Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).
- Reece-Hoyes, J. S., et al. Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network. Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).
- Carrasco Pro, S., et al. Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).
- Whitfield, T. W., et al. Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters. Genome Biology. 13 (9), R50 (2012).
- Fuxman Bass, J. I., et al. Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters. Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).
- Hens, K., et al. Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements. Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).
- Gubelmann, C., et al. A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks. Molecular Systems Biology. 9, 682 (2013).
- Brady, S. M., et al. A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root. Molecular Systems Biology. 7, 459 (2011).
- Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).
- Burdo, B., et al. The Maize TFome–development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics. The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).
