التقييم المورفولوجي والوظيفي لمناصات الشريط في مناطق تردد محددة من القوقعة الماوس
Summary
تصف هذه المخطوطة بروتوكولًا تجريبيًا لتقييم الخصائص المورفولوجية والحالة الوظيفية لمناصات المشبك الشريطية في الفئران العادية. النموذج الحالي هو أيضا مناسبة للنماذج التي تسببها الضوضاء والمرتبطة بالعمر cochlear متشابك المشبك. كما تتم مناقشة النتائج النسبية لدراسات الماوس السابقة.
Abstract
خلايا الشعر الداخلية القوقعة (IHCs) نقل الإشارات الصوتية إلى الخلايا العصبية العقدة دوامة (SGNs) من خلال نقاط الاشتباك العصبي الشريط. وقد أشارت العديد من الدراسات التجريبية إلى أن نقاط الاشتباك العصبي لخلايا الشعر قد تكون الأهداف الأولية في فقدان السمع الحسي العصبي (SNHL). وقد اقترحت هذه الدراسات مفهوم “اعتلال الشبكية” القوقعة، الذي يشير إلى التعديلات في عدد متشابك الشريط، أو الهيكل، أو وظيفة التي تؤدي إلى انتقال متشابك غير طبيعي بين IHCs وSGNs. في حين أن اعتلال الشبكي القوقعة لا رجعة فيه، فإنه لا يؤثر على عتبة السمع. في النماذج التجريبية الناجمة عن الضوضاء، يتم استخدام الأضرار المقيدة لنقاط الاشتباك IHC في مناطق تردد مختارة لتحديد العوامل البيئية التي تسبب على وجه التحديد اعتلال المشبك، فضلا عن العواقب الفسيولوجية لإزعاج هذه الأذن الداخلية الدائره. هنا، نقدم بروتوكول لتحليل مورفولوجيا متشابك القوقعة وظيفة في منطقة تردد محددة في الفئران الكبار. في هذا البروتوكول، يتم إجراء توطين القوقعة في مناطق تردد محددة باستخدام خرائط تردد المكان بالاقتران مع بيانات cochleogram، وبعد ذلك يتم تقييم الخصائص المورفولوجية لنقاط الاشتباك العصبي الشريطية عن طريق متشابك تلطيخ المناعة. ثم يتم تحديد الوضع الوظيفي لنقاط الاشتباك العصبي الشريط على أساس السعة من استجابة جذع الدماغ السمعي (ABR) موجة I. ويبين هذا التقرير أن هذا النهج يمكن استخدامه لتعميق فهمنا للأمراض وآليات الخلل المتشابك في القوقعة، مما قد يساعد في تطوير تدخلات علاجية جديدة.
Introduction
يمكن أن ينظر البشر إلى الترددات التي تتراوح بين 20 و201220,000 هرتز تقريباً على أنها محفزات سمعية. عادة ما تكون السمع البشري أكثر حساسية بالقرب من 1000 هرتز، حيث يبلغ متوسط مستوى ضغط الصوت 20 درجة مئوية في البالغين الصغار (أي 0 ديسيبل من مستوى ضغط الصوت [dB SPL]). في بعض الحالات المرضية، يقتصر فقدان السمع على ترددات محددة. على سبيل المثال، في المراحل المبكرة من فقدان السمع الناجم عن الضوضاء (NIHL)، يمكن ملاحظة “درجة” (أي ارتفاع عتبة السمع) في الرسم الصوتي عند kHz4 1. على طول قسم القوقعة الثدييات، تدرجاتها من صلابة وكتلة تنتج خريطة تردد الأسي، مع الكشف عن الصوت عالية التردد في قاعدة القوقعة والكشف عن التردد المنخفض في قمة2. في الواقع، هناك خريطة cochlear مكان تردد على طول الغشاء القاعدي، مما يؤدي إلى ما يعرف باسم منظمة التنورة2،3. كل مكان معين على غشاء باسيلار لديه أعلى حساسية لتردد صوت واحد فقط معين، والذي يسمى عادة التردد المميز3،4، على الرغم من أن الردود على الترددات الأخرى يمكن أيضا أن يلاحظ.
حتى الآن، تم استخدام نماذج الماوس المختلفة للتحقيق في الوظيفة العادية، والعمليات المرضية، والفعالية العلاجية في النظام السمعي. المعرفة الدقيقة للمعلمات الفسيولوجية في القوقعة الماوس هو شرط مسبق لمثل هذه الدراسات من فقدان السمع. وينقسم قوقعة الماوس تشريحيا إلى المنعطفات apical، الأوسط، والقاعدية، والتي تتوافق مع مناطق تردد مختلفة. من خلال وضع العلامات على afferents العصب السمعي في نواة القوقعة لتحليل مواقع التعصيب المحيطي المقابلة في القوقعة، نجح مولر وآخرون في إنشاء خريطة تردد مكان القوقعة في الماوس العادي في الجسم الحي5. في الفاصل الزمني من 7.2-61.8 كيلو هرتز، والذي يتوافق مع المواقف بين 90٪ و 10٪ من الطول الكامل للغشاء القاعدي، يمكن وصف خريطة تردد مكان قوقعة الماوس بواسطة وظيفة الانحدار الخطي بسيطة، مما يشير إلى وجود علاقة بين تطبيع المسافة من قاعدة القوقعة ولوغاريتم الترددالمميز 5. في الفئران المختبرية، يمكن استخدام خريطة تردد المكان لاستكشاف العلاقة بين عتبات السمع ضمن نطاقات تردد محددة ومخططات cochleograms التي تبين أعداد خلايا الشعر المفقودة في المناطق النسبية على طول الغشاء القاعدي6. الأهم من ذلك، توفر خريطة تردد المكان نظام تحديد المواقع للتحقيق في الحد الأدنى من الأضرار الهيكلية، مثل الأضرار التي لحقت نقاط الاشتباك العصبي الشريط من خلايا الشعر في مواقع محددة تردد القوقعة في الفئران مع الصدمة السمعية الطرفية7 ،8.
في القوقعة الثدييات، يتكون نقاط الاشتباك العصبي الشريط من الشريط presynaptic، والإسقاط كثيفة الإلكترون أن الحبال هالة من الحويصلات متشابك جاهزة للإفراج تحتوي على الغلوتامات داخل IHC، وكثافة postsynaptic على المحطة العصبية من SGN مع مستقبلات الغلوتامات9. أثناء [قlear] صوة [ترندوسكأيشن], ينتج إنحراف من الشعر خلية حزمة في [إيهك] [دّوكأيشنل], أيّ يقود إلى [غلومت] إطلاق من [إيهك] على ال [ستبّيبتيك] [أفيرنت] انتهائيّة, بذلك ينشط المسار سمعيّة. تفعيل هذا المسار يؤدي إلى تحويل الإشارات الميكانيكية التي يسببها الصوت إلى رمز معدل في SGN10. في الواقع، فإن مشبك الشريط IHC متخصص للغاية لنقل الصوت الذي لا يكل بمعدلات مئات من هيرتز مع دقة زمنية عالية، وله أهمية حاسمة لآليات presynaptic من ترميز الصوت. وقد كشفت الدراسات السابقة أن نقاط الاشتباك العصبي الشريط تختلف اختلافا كبيرا في الحجم والعدد في مناطق تردد مختلفة في القوقعة الماوس الكبار11،12، مما يعكس على الأرجح التكيف الهيكلي لالترميز الصوت معينة ل احتياجات البقاء على قيد الحياة. في الآونة الأخيرة، أظهرت الدراسات الحيوانية التجريبية أن اعتلال الشبكيالق يساهم في أشكال متعددة من ضعف السمع، بما في ذلك فقدان السمع الناجم عن الضوضاء، وفقدان السمع المرتبط بالعمر، وفقدان السمع الوراثي13، 14– وهكذا، فإن أساليب تحديد التغيرات المترابطة في عدد متشابك، وهيكل، ووظيفة في مناطق تردد محددة قد استخدمت بصورة متزايدة في دراسات التطور السمعي وأمراض الأذن الداخلية، وذلك باستخدام النماذج التي تم إنشاؤها عن طريق المعالجة التجريبية للمتغيرات الوراثية أو البيئية15،16،17.
في هذا التقرير، نقدم بروتوكول او تحليل عدد متشابك، وهيكل، وظيفة في منطقة تردد محددة من غشاء القاعدية في الفئران الكبار. يتم إجراء تعريب تردد القوقعة باستخدام خريطة تردد مكان معين في تركيبة مع مخطط قوقعة. يتم تقييم الخصائص المورفولوجية الطبيعية لمناقانات الشريط القوقعة عن طريق تلطيخ المناعة presynaptic وpostsynaptic. يتم تحديد الحالة الوظيفية لمناقان اتّشبك شريط القوقعة استناداً إلى السعة فوق العتبة للموجة ABR I. مع تعديلات طفيفة، يمكن استخدام هذا البروتوكول لفحص الظروف الفسيولوجية أو المرضية في النماذج الحيوانية الأخرى، بما في ذلك الفئران والخنازير غينيا، وgerbils.
Protocol
Representative Results
Discussion
منذ تم وصف اعتلال الشبكي القوقعة لأول مرة في الفئران الكبار مع تحول عتبة مؤقتة (TTS) الناجمة عن 8\u201216 كيلوهرتز الضوضاء الفرقة اوكتاف في 100 ديسيبل SPL لمدة 2 ح31, وقد حقق الباحثون على نحو متزايد آثار اعتلال الكلى في مختلف الثدييات، بما في ذلك الكبيتو والبشر32،<sup class=…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81770997، 81771016، 81830030)؛ مشروع التمويل المشترك لمؤسسة بكين للعلوم الطبيعية ولجنة بكين للتعليم (KZ201810025040)؛ مؤسسة بكين للعلوم الطبيعية (7174291)؛ والمؤسسة الصينية لعلوم ما بعد الدكتوراه (2016M601067).
Materials
| Ketamine hydrochloride | Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China | H35020148 | 100mg/kg |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | X-1251 | 10mg/kg |
| TDT physiology apparatus | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | Auditory Physiology System III | |
| SigGen/BioSig software | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | Auditory Physiology System III | |
| Electric Pad | Pet Fun | 11072931136 | |
| Dumont forceps 3# | Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada | 0203-3-PO | |
| Dumont forceps 5# | Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada | 0209-5-PO | |
| Stereo dissection microscope | Nikon Corp., Tokyo, Japan | SMZ1270 | |
| Goat serum | ZSGB-BIO, Beijing,China | ZLI-9021 | |
| Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4 | Millipore Corp., Billerica, MA, USA | MAB397 | mouse |
| Purified Mouse Anti-CtBP2 | BD Biosciences, Billerica, MA, USA | 612044 | mouse |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | A21124 | goat |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | A21131 | goat |
| Mounting medium containing DAPI | ZSGB-BIO, Beijing,China | ZLI-9557 | |
| Confocal fluorescent microscopy | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS SP8 II | |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Professional diagnostic pocket otoscope | Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China | HS-OT10 | |
| Needle electrode | Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China | 1029 | 20 mm, 28 G |
| Closed-field speaker | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | CF1 | |
Riferimenti
- Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers. Ear and Hearing. 36 (3), 86-92 (2015).
- Fettiplace, R. Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
- Liberman, M. C. The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency. Journal of the Acoustical Society of America. 72 (5), 1441-1449 (1982).
- Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
- Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
- Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-2), 1-10 (2004).
- Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6, 25056 (2016).
- Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in “recovered” ears. Journal of Neuroscience. 35 (19), 7509-7520 (2015).
- Wichmann, C., Moser, T. Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 361 (1), 95-114 (2015).
- Matthews, G., Fuchs, P. The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 812-822 (2010).
- Liberman, L. D., Liberman, M. C. Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area. Hearing Research. 339, 12-22 (2016).
- Yang, L., et al. Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice. Acta Oto-Laryngologica. 138 (1), 25-30 (2018).
- Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms. Hearing Research. 349, 138-147 (2017).
- Moser, T., Starr, A. Auditory neuropathy–neural and synaptic mechanisms. Nature Reviews Neurology. 12 (3), 135-149 (2016).
- Yu, W. M., et al. A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing. Elife. 2, 01341 (2013).
- Buniello, A., et al. Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing. EMBO Molecular Medicine. 8 (3), 191-207 (2016).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure. Scientific Reports. 7 (1), 1054 (2017).
- Kane, K. L., et al. Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice. Hearing Research. 283 (1-2), 80-88 (2012).
- Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta). International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (10), 19058-19064 (2015).
- Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. Mouse auditory brainstem response testing. BIO-Protocol. 6 (6), (2016).
- Zhou, X., Jen, P. H. -. S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice. Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
- Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein’s journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function. Neuron. 28 (3), 857-872 (2000).
- Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure. Scientific Reports. 6, 24907 (2016).
- Rutherford, M. A. Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy. Synapse. 69 (5), 242-255 (2015).
- Liberman, L. D., Liberman, M. C. Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16 (2), 205-219 (2015).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
- Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
- Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline. Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
- Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after “temporary” noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Valero, M. D., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta). Hearing Research. 353, 213-223 (2017).
- Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
- Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (3), 321-329 (2013).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
- Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice. Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).
- Mehraei, G., et al. Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy. Journal of Neuroscience. 36 (13), 3755-3764 (2016).
