根治的前立腺切除術後の勃起不全治療のための脂肪由来再生細胞の単離

プロトコルに記載されているすべての方法は、デンマーク国家倫理委員会(第37054号)、デンマーク保健医薬品局(EUDRA-CT番号2013-004220-11)、およびデンマークデータ保護庁(2008-58-0035)によって承認されました。この研究は ClinicalTrials.gov に登録された(NCT02240823)。この研究は、オーデンセ大学病院のGood Clinical Practice(GCP)ユニットによって監視されたヘルシンキ宣言に従って実施された。ADRC調製は、オーデンセ大学病院におけるヒト組織および細胞の取り扱いのための認可組織施設(デンマーク保健医薬品局、認可番号29035)において実施された。 1. 患者・参加者の募集 治験に参加するには、以下の包含基準を満たす患者を募集する。 18歳以上で、RPの前に性的に活動的であり、性感染症(ヒト免疫不全ウイルス感染、梅毒、肝炎など)に感染していない患者を募集する。 前立腺癌のために行われたRPの後に勃起不全に苦しんでいることを確認してください。注:この研究では、患者はRPの5〜18ヶ月後に研究に登録され、手術方法(オープン/ロボットアシストまたは神経温存/非神経温存)に関係なく含まれていました。 前立腺特異抗原(PSA)の価値がRP後の臨床フォローアップで検出不可能でなければならないことを確認してください。 患者がRPの前に性的に活動的であり、RP後も性的に活動的であり続けたいという願望を表明していることを確認する。ホスホジエステラーゼ5型阻害剤(PDE5阻害剤)またはプロスタグランジンE1の合成類似体(PGE1)による薬理学的介入が、参加する前に試行され、不十分であるとみなされることを確認する。 さらに、患者が腹部または大腿部に十分な皮下脂肪を有することを確認する。 RP中に麻酔下で重篤な事象があった場合、または抗凝固剤で治療された場合は、患者を試験から除外する。 2. 脂肪吸引 注:脂肪吸引は、皮下領域から脂肪または脂肪細胞を除去する操作である。プロトコルのこの部分は標準的な脂肪吸引として行われ、手順は手術室で滅菌条件下で行われる。手順の下で使用されるすべての器具は無菌でなければならず、外科医はスクラブ、滅菌手術用ガウン、滅菌手袋、手術用マスクおよび帽子を着用しなければならない。 患者を麻酔する。 処置中に患者が全身麻酔下にあることを確認し、この部分は麻酔科医によって行われる。 腹部および陰嚢の皮膚をクロルヘキシジン0.5%で消毒する(クロレキシジン精神、96%エタノール薬用ジグルコン酸クロルヘキシジン77%W / W = 83% v / v)。外科的マーカーを使用して、脂肪吸引が行われる予定であった腹部上の領域を描画する。領域は通常、交感神経と臍の間の領域になります。 メスで腹部の皮膚に幅6mmの切開を2回行う(数11)。切開部を脂肪吸引の上方から左右対称に配置する。 ワセリンなどの潤滑剤を少し切開部に置き、脂肪吸引中に浸潤カニューレが切開部に容易に出入りすることを確認します。 皮膚の切開部を通してサイズ14G浸潤カニューレを導入する。修正されたクライン溶液を皮膚表面に平行なマークされた領域に皮下に注入する。標的組織が腫れて固くなる、または腫瘍になるほど多くの溶液を注入する。注:改変されたクライン溶液は、1,000mL乳酸リンゲルおよび1mgのアドレナリン(エピネフリン(1:1,000,000))の溶液からなる。局所麻酔を溶液に当てはめないでください, それはADRCに悪影響を及ぼす可能性があるため、. 脂肪組織に1:1の比率に対応する量の改変クライン溶液を注入する。 アドレナリンの効果を最大化し、採取された脂肪組織の血液量を減らすために10分間待つ。 ジェット注入脂肪吸引を用いて標準的な脂肪吸引を行い、200〜300mLの脂肪組織を採取する。注入チューブとノズルが一体化された中空の鈍いカニューレを使用してください。カニューレを脂肪吸引用の吸引装置に取り付けます。注:連続的な扇形の水注入は、脂肪組織を緩めて断片化し、カニューレの開口部から容易に吸引することができる。 腹部の切開部を通して鈍い先端を持つ3mmシリンジを導入する 脂肪組織をリポコレクタに集めて、脂肪吸引液を無菌環境で保存する。脂肪吸引液は水相から分離し始めます。 50 mLの滅菌シリンジを使用して、リポコレクターから脂肪吸引液を吸い上げます。 シリンジに吸い込まれる水の量を最小限に抑え、シリンジの先端にあるプラグをねじ込んで脂肪組織を滅菌に保ちます。 先端が下向きの注射器を滅菌ビニール袋に入れ、水相からの脂肪吸引液の分離を開始する。先端を下向きにしたまま袋を滅菌容器に入れ、分離を続けます。 輸送中の無菌環境を確保するために、容器を滅菌ドレープで覆います。注:単離に使用された機械のユーザーマニュアルによると、脂肪吸引液はADRCの単離前に最大4時間保存することができますが、常にすぐに処理します。 外科医が好む縫合材料で皮膚切開部を閉じる。腹部の周囲に圧迫衣服、腹部結合剤を置き、術後の浮腫を軽減します。 5μgのアドレナリンを含む20mLのブピバカイン5mg / mLを注射することによって陰茎ブロックを作る。 20 mLの注射器を使用し、長さ1 1/4インチの23 G針で塗布します。 5mLのブピバカインをサブクティスの各象限に塗布する。 ブピバカインを2つの部位に注入し、一方を腹側に置き、他方を背側に配置する。針を横方向に右に向ける皮下組織にその長さの全体にわたって針を導入し、針が引っ込められるように麻酔を注入する。針を左に向けて注射を繰り返します。注:患者は、麻酔科医によって全身麻酔から目覚めさせることができるようになった。 3. ADRCの分離 メモ: ADRC の絶縁プロセスは、デバイスの次のユーザーマニュアルに詳しく説明されているように実行されます ( 材料表を参照)。ADRCの精製中に脂肪吸引液がいかなる汚染物質にも曝されないようにするために、この手順を滅菌条件下で実施することが重要である。ADRCの単離にかかる時間は、脂肪吸引液の量に依存するが、ここで説明するように半自動装置を使用して、全体の手順は約2.5時間かかる。 すべての消耗品と酵素を、滅菌使い捨て手術用タオルで覆われたテーブルに無菌的に置きます。注:手順キットには、1人の患者からADRCを単離するために必要なすべての消耗品と酵素が含まれています。これに加えて、3つの37-39°C、1リットルの乳酸リンガーの注入バッグは、滅菌衣類、手袋、タオル、消毒用のエタノールとともに利用可能でなければなりません。消耗品と酵素のすべてのロット番号と、システムに接続されている場合は、授乳リンガーの温度を書き留めます。 エタノールでデバイスを拭き取り、製造元の指示に従ってください 消耗品セットをデバイスにロードし、乳酸リンガーの袋をシステムに接続します。 脂肪吸引液を添加する前に、一連の半自動試験(システムチェックおよびリーク試験)を行う。 3.1のステップが行われている間、脂肪吸引液を50mLチューブに入れたままにします。これにより、脂肪が液相から分離することができます。脂肪組織の総量(mL単位)を書き留め、これを使用して、負荷された脂肪の量がデバイスの容量の範囲にあることを確認します。 デバイスからプロンプトが表示されたら、ティッシュをロードします。機械は余分な水分を排出し、乳酸リンガーで洗浄する前に負荷された脂肪組織の量の重量を量ります。 組織を洗浄し、再び排水したら、機械の要求に応じて、新しい輸液バッグを37-39°Cの乳酸リンガーで接続します。 コラゲナーゼとプロテアーゼを含む市販の酵素を5mLの乳酸リンゲルブレンドで再構成します(酵素のバイアル1本で最大270mLの脂肪量で十分です)。 脂肪組織を含むキャニスターに注入する酵素の量 (組織重量に基づく) が装置に表示されていることを確認します。一旦注入されると、攪拌下で行われる酵素消化は約20分間持続する。 組織消化後、攪拌機を停止し、含有量が2つの相に分離されていることを確認します:上部脂質含有、黄色相、およびADRCを含む下部ピンク層。後者の層を消耗品セットの細胞処理チャンバ(装置内蔵遠心分離機に入る)に排水させ、脂質層を残します。 ADRCを細胞処理チャンバ内で複数回の遠心分離中に濃縮させます。次に、乳酸リンガーで再構成された10mLのイントラバス(DNaseを含み、最終的なADRC懸濁液中の凝集を避けるのに役立ちます)を加えます。酵素反応は10分間続き、その後ADRCを洗浄する。メモ:この手順は完全に自動で行われ、プロセスが完了すると機械が通知します。 ADRC の単離が完了したら、細胞を 5 mL のリンゲル乳酸塩に再懸濁します。溶液を5mLシリンジに吸引する。 ADRCを含む5 mLシリンジに3ウェイ活栓メスルアーロックを取り付け、4 mLのADRCを別の5 mL滅菌シリンジに吸引します。 最後の1 mLを1 mLシリンジに移します。この1mLをADRCの特性評価(例:細胞数、細胞生存率、フローサイトメトリーによる表面マーカーの分析、ADRC分化能)に使用します。 滅菌ドレープに詰める前に、4mLのADRCを入れた5mLシリンジに25G針を刺します。受信者への注入に ADRC を使用します。この場合、ADRCの溶液は平均して840万〜3270万個の細胞を含む。 4. コーパス・カベルノサムへのADRCの移植 注:これは滅菌手順です。すべての器具は滅菌でなければならず、幹細胞を含む溶液をコーパスキャベルノサムに注入する人は滅菌手袋を着用しなければならない。患者はこの手順中に目を覚ましており、自分の幹細胞を受け取ります。ADRCは、注射前に細胞を計数することなく注入される。 ADRCsの溶液を均質に保つには、シリンジをコーパスカベルノサムに注入するまで静かに傾けます。 ペニスの上に絞りドレープを置きます。シリコン容器ループを使用して陰茎の根元に止血帯を置きます。ループを締め、鉗子湾曲したピーンで固定します。止血帯をペニスからの血流を止めるのに十分なほどタイトにします。 注射部位(コーパスカベルノサムの側方部位)で陰茎の皮膚を消毒するために、2つの消毒スワップを使用する。ADRCsを含む溶液1mLを、右側のコーパスキャベルノサムに直角に2つの異なる場所で注入し、その後左側コーパスカベルノサムでこのステップを繰り返す。注入されたADRCの総量は4mLである。 30分待ってから止血帯を取り外します。 ADRCsの注射後2時間の観察後に患者を退院させ、患者が麻酔後に良好に回復したことを確認する。 5. 術後ケア 血腫の発症を防ぐために、最初の1週間以内に血圧を上昇させることができる身体的パフォーマンスを行わないように患者に推奨する。 手術後最初の14日間は24時間、日中は14日間腹部バインダーを着用することを患者に推奨する。 経口アセトアミノフェン(例えば、パラセタモール;1,000mg、1日4回)および経口抗炎症剤(例えば、イブプロフェン;400mgを1日3回)で術後疼痛を治療する。