コウジカビ flavusの生育と遺伝子組換えトウモロコシはフジマメ属液体l. から α-アミラーゼ阻害剤を表現するアフラトキシン生産阻害
Summary
ここでコウジカビ flavusの生育および抗真菌性蛋白を発現するトウモロコシのアフラトキシン生産を分析するためのプロトコルを提案する. 我々 は、感染とリアルタイムで成熟したカーネルでは菌の拡散を監視 gfp 発現するA. flavusひずみを用いたします。アッセイは、急速な信頼性と再現性です。
Abstract
食品及び飼料作物のアフラトキシン汚染は、世界中の主要な課題です。アフラトキシン、病菌Aspergillus flavus (A. flavus) は、トウモロコシと人間や動物の健康に深刻な脅威のポーズ以外にもピーナッツのような他の石油の豊富な作物作物の値を大幅に削減する強力な発ガン性物質です。従来の育種、遺伝子組換え発現の抵抗性関連蛋白質と RNA 干渉 (RNAi) など、さまざまなアプローチ-重要なA. flavusのホスト-誘導性遺伝子のサイレンシングを用いた遺伝子ターゲットが増加する評価されて影響を受けやすい作物でアフラトキシン抵抗。過去の研究では、α-アミラーゼこの遺伝子・酵素を示唆、 A. flavus病態とアフラトキシン生産の重要な役割は、 A. flavusの生育とアフラトキシン生産の両方を削減する潜在的な目標を示しています。この点で、現在の研究は、 A. flavusに対するトウモロコシのフジマメ属液体l. の α-アミラーゼ阻害剤のようなタンパク質 (AILP) の (構成 CaMV 35Sプロモーターの制御) の下で異種の式を評価する行われました。AILP A. flavus α-アミラーゼ酵素の競合阻害であり共通の豆のレクチン-arcelin-α-アミラーゼ阻害剤タンパク質ファミリーに属する 36 kDa 蛋白質であります。現在の仕事の前に、in vitro 試験は、 A. flavus α-アミラーゼ活性と真菌の増殖の抑制における AILP の役割を発揮していた。真菌の成長および成熟したカーネルでアフラトキシン生産は、gfp 発現するA. flavusひずみを使用してリアルタイムで監視されました。このカーネル スクリーニングアッセイ (サウジアラビア) を非常に簡単に設定し、感染症・定量化することができる広がりの程度遺伝と形質転換線の評価のため信頼性が高く、再現性のあるデータを提供します。GFP のひずみから蛍光が密接に相関する真菌の成長、延長によって、それはアフラトキシンの値に相関関係にあります。 現在の仕事の目標は、アフラトキシンの抵抗を増加するためにトウモロコシのような商業的に重要な作物でこの前知識を実装することでした。我々 の結果は、AILP を表現する遺伝子組換えトウモロコシのカーネルではターンでは、アフラトキシンの 62-88% 減少に翻訳するA. flavus成長 35-72% 減少を示します。
Introduction
真菌属、アルテルナリアペニシリウム、フザリウム麹菌によるマイコトキシン汚染食品の主要な問題は、飼料作物栽培世界中1,2,3.これらの植物病原性菌の中で麹菌がトリミングの値と人間や動物の健康に及ぼす悪影響最高です。コウジカビ flavus(A. flavus) は、トウモロコシ、綿、ピーナッツなどのオイル豊富な作物に感染する、強力な発ガン性物質アフラトキシン、多数の有毒な二次代謝産物 (SMs) を生成日和見植物病原体です。トウモロコシの重要な食糧は、世界的な栽培作物をフィードし、 A. flavusによる汚染に非常に敏感であります。アフラトキシン汚染の経済的影響を失うとトウモロコシの減少値が地球規模の気候に限り $ 6 億 8660 万/年の米国2予測の変更をすることができます、アフラトキシンの影響とトウモロコシの大きな経済的損失につながる近い将来2に $ 16 億 8000 万/年として、高い見積もり。人間や家畜にアフラトキシンの経済と健康の悪影響を考えると、トウモロコシの収穫前アフラトキシン コントロールは食品のアフラトキシン汚染を防止し、飼料製品を最も効率的な方法かもしれない。
最後の数十年間で広く使用されているトウモロコシのアフラトキシン抵抗の主要な収穫前コントロール アプローチは、4時間のかなりの量を必要とする繁殖を中心にです。最近、生物的防除は、大規模なフィールド アプリケーション5,6アフラトキシン削減いくつかの成功を収めています。生物的防除、ほか 『 ホストによる遺伝子サイレンシング 』 (HIGS) を RNAi など最先端の分子ツールのアプリケーションと耐性関連蛋白の遺伝子組換え発現は、 A. flavusの生育とアフラトキシンの削減にいくつかの成功を収めています。小規模な実験室とフィールド研究の生産。これらのアプローチは、今後の操作のための新しい潜在的なA. flavus遺伝子ターゲットを識別する作業に加えて現在最適化されています。
初期段階の間に成功した病態とマイコトキシンの生産を維持するために重要な役割を再生するマイコトキシン産生遺伝子制御戦略の潜在的なターゲットとしてプロセスに直接かかわる遺伝子以外にも真菌アミラーゼが示されています。ホスト植物の感染。いくつかの例を含めるPythium pleroticum (ショウガ根茎腐敗病菌)、新称(カリフラワー病の病原)、α-アミラーゼと病原性の発現と活性と正の相関関係がを認められました。7,8。遺伝子ノックアウトまたはノックダウン アプローチを通じての α-アミラーゼ活性の阻害は、真菌の成長および毒素生産悪影響を与えます。A. flavusの α-アミラーゼ欠損株では、澱粉基板または degermed トウモロコシ9上に成長した場合、アフラトキシンを生成できませんでした。同様に、フザリウム関係でノックアウト、α-アミラーゼのひずみはトウモロコシ10の感染中のフモニシン B1 (マイコトキシン) を生成する失敗しました。最近の研究でギルバートら (2018 年) を示した HIGS を行ったところ A α-アミラーゼ式の RNAi によるノックダウンがトウモロコシ カーネル感染11 A. flavusの生育とアフラトキシン生産を大幅に削減.
Α-アミラーゼの発現のダウンレギュレーションをから得られる、同様の結果を作り出したの α-アミラーゼ活性の特異的阻害剤も。カビ抵抗性の α-アミラーゼ阻害剤の役割の最初のレポートは、分離・ A. flavus12に抵抗力があるトウモロコシ系統から 14 kDa のトリプシン-α-アミラーゼ阻害剤の同定から来た。さらにヒヤシンス豆、フジマメ属液体l.13の種子から Fakhoury と 36 kDa の α-アミラーゼ阻害剤のようなタンパク質 (AILP) の同定につながった Woloshuk によって植物種の数百のスクリーニング。レクチン-arcelin-α – アミラーゼインヒビターの家族に属しているに似ている AILP レクチンのペプチッド シーケンスは共通豆14,15を報告しました。精製 AILP は、哺乳類のトリプシンとさらに体外評価A. flavusの成長と胞子の発芽13, 有意に阻害を示した方はまったく阻害活性を示しません。報告書ここではっきりショー α-アミラーゼとして使用できる病原体または澱粉 (α – アミラーゼ) を動員と中にエネルギー源としての糖の獲得に依存する害虫を制限する制御アプローチでターゲットの宿主植物と病原菌の相互作用。
Α-アミラーゼは、 A. flavus病原性9,10、11、として強力な抗 –A. flavusエージェント (α-アミラーゼ阻害/antigrowth)13AILP の重要性を考えると重要なことに知られています。フジマメ属AILPを表現する遺伝子組換えトウモロコシ植物を生成した構成 CaMV 35S プロモーター遺伝子。目標は、トウモロコシのこの α – アミラーゼインヒビターの異種発現トウモロコシ カーネル感染時にA. flavus病態とアフラトキシン生産に対して有効である場合、調査することでした。大幅 AILP を表現する遺伝子組換えトウモロコシがカーネル感染時にA. flavusの生育とアフラトキシン生産を減らしたことを示した。
Protocol
Representative Results
Discussion
病原体や害虫による農作物の収量の損失は、地球規模の問題20です。現在、合成殺菌剤と殺虫剤のアプリケーションが制御する植物病原菌や害虫のための有力な手段が、これらの発酵食品や飼料中の残留毒性は人間と動物の健康21に深刻な脅威を提起できます。食品と飼料作物としてトウモロコシの経済的重要性を考えるの削減やアフラトキシン汚染の除去…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
デビッド Meints、アーカンソー大学の開発と初期世代の中に遺伝子組み換えトウモロコシを分析の彼の援助に感謝いたします。この仕事は、USDA-ARS クリス プロジェクト 6054-42000-025-00D の金融サポートを受け取った。商号またはこの資料の商用製品の言及は固有の情報を提供する目的は、勧告または米国農務省によって承認とは限りません。米国農務省アルス ‘ 平等雇用機会均等政策すべての人に平等な機会を義務付けし、代理店の人事政策、プラクティス、および操作のすべての面で差別を禁止します。
Materials
| Agar | Caisson | ||
| Amazing Marine Goop | Eclectic Products | ||
| C1000 Touch CFX96 Real-Time System | Bio-Rad | ||
| Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm | Fisher Scientific | 08-772F | |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | Fisher Scientific | ||
| Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL | Ace Glass | 6999-10 | |
| Ethanol | |||
| FluoroQuant Afla | Romer Labs | COKFA1010 | |
| Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm | Fisher Scientific | 09-790-14E | |
| Force Air Oven | VWR | ||
| FQ-Reader | Romer Labs | EQFFM3010 | |
| Geno/Grinder 2010 | OPS Diagnostics | SP 2010-115 | |
| Innova 44 Incubator Shaker | Brunswick Scientific | ||
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| liquid Nitrogen | |||
| Low Form Griffin Beakers, 100 mL | DKW Life Sciences | 14000-100 | |
| Methanol | |||
| Methylene Chloride | |||
| Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants | Nexttec | 47N | |
| Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera | Nikon | ||
| Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera | Nikon | ||
| Nunc Square BioAssay Dishes | ThermoFisher Scientific | 240835 | |
| Phire Plant Direct PCR Kit | ThermoFisher Scientific | F130WH | |
| Polycarbonate Vials, 15 ml | OPS Diagnostics | PCRV 15-100-23 | |
| Potato Dextrose Broth | |||
| Snap Cap, 22 mm | DKW Life Sciences | 242612 | |
| Sodium Phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | ||
| Spectrum Plant Total RNA Kit | Sigma-Aldrich | STRN50 | |
| Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' | OPS Diagnostics | GBSS 375-1000-02 | |
| Stir Plate | |||
| Synergy 4 Fluorometer | Biotek | ||
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| V8 juice | Campbell's | ||
| Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 | Fisher Scientific | 09-820P | |
| Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific |
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