JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscienze

Inyección directa de un Vector lentivirales destaca múltiples caminos del Motor en la médula espinal de rata

Published: March 15, 2019
doi:
10.3791/59160
, , , ,
1Shriner’s Pediatric Research Center,Temple University

Summary

Este protocolo muestra la inyección de un vector viral retrogradely transportable en tejido de médula espinal de rata. El vector es tomado en la sinapsis y transportado al cuerpo celular de las neuronas de destino. Este modelo es adecuado para rastreo retrógrada de importantes vías espinales o dirigidos a las células para usos de la terapia génica.

Abstract

Introducir proteínas de interés en las células en el sistema nervioso es difícil debido a las barreras biológicas innatas que limitan el acceso a la mayoría de las moléculas. Inyección directamente en el tejido de la médula espinal pasa por alto estas barreras, proporcionando acceso a los cuerpos de la célula o sinapsis donde las moléculas pueden ser incorporadas. Combinando tecnología de vector viral con este método permite la introducción de genes de la blanco en tejido nervioso con el fin de la terapia génica o el trazado de vías. Aquí se introduce un virus diseñado para un transporte retrógrado altamente eficiente (HiRet) en las sinapsis de interneuronas propiospinal (PNs) para fomentar el transporte específico para neuronas en la médula espinal y los núcleos del médula oblonga. Dirigidas a PNs aprovecha las numerosas conexiones que reciben de los caminos del motor como los tractos rubroespinal y reticulospinal, así como su interconexión con los demás a lo largo de los segmentos de la médula espinal. Representante de seguimiento utilizando el vector de HiRet con detalles de alta fidelidad de espectáculos constitutivamente activa proteína verde fluorescente (GFP) de cuerpos celulares, axones y cenadores dendríticos PNs torácicas y reticulospinal neuronas en la formación reticular del pontine. HiRet incorpora en vías del médula oblonga y PNs pero muestra integración dependiente de edad en las neuronas del tracto corticoespinal. En Resumen, la inyección de médula espinal usando vectores virales es un método adecuado para la introducción de proteínas de interés en las neuronas de las zonas específicas.

Introduction

Vectores virales son importantes herramientas biológicas que pueden introducir material genético en las células con el fin de compensar los genes defectuosos, proteínas de crecimiento importante de alza o fabricar proteínas marcadoras que ponen de relieve la estructura y conexiones sinápticas del sus objetivos. Este artículo se centra en la inyección directa de un vector lentivirales retrogradely transportable muy eficiente en la médula espinal de rata para resaltar los caminos importantes del motor con trazo fluorescente.  Este método también es muy apropiado para estudios de regeneración y regeneración axonales a introducir proteínas de interés en diversas poblaciones de neuronas y se ha utilizado para silenciar a las neuronas para mapeo funcional estudios1,2.

Muchos de los detalles anatómicos de las vías motor espinales fueron aclados mediante estudios de inyección directa con marcadores clásicos como la BDA y fluoro-oro3,4,5,6,7 , 8. estos marcadores se consideran patrón oro pero pueden tener ciertas desventajas como la absorción por axones dañados, o axones en pasaje de la materia blanca circundante una inyección sitio9,10,11 . Esto podría llevar a interpretaciones incorrectas de la conectividad vía y puede ser un inconveniente en los estudios de regeneración donde podría confundir con absorción de tinte por axones dañados o cortadas para regenerar las fibras durante el más adelante análisis12.

Vectores lentivirales son populares en estudios de terapia génica, ya que proporcionan la expresión estable y a largo plazo en poblaciones neuronales13,14,15,16,17,18 ,19. Sin embargo, tradicionalmente envasados vectores lentivirales puede haber limitado el transporte retrógrado y dispare la respuesta del sistema inmunitario cuando se utiliza en vivo4,20,21. Un vector de transporte retrógrado muy eficiente llamado HiRet ha sido producido por Kato et mediante la modificación de la envuelta viral con una glicoproteína del virus rabia para crear un vector híbrido que mejora el transporte retrógrado22,23.

Trazado retrógrado introduce un vector en el espacio sináptico de la neurona de destino, lo que le permite ser tomado por el axón de la célula y transportados al cuerpo de la célula. Ha demostrado éxito transporte de HiRet de sinapsis neuronales en los cerebros de ratones y primates23,24 y de los músculos en las neuronas de motor22. Este protocolo muestra la inyección en la médula espinal lumbar, específicamente dirigidos a los terminales sinápticos de propiospinal interneuronas y las neuronas del tronco encefálico. PNs reciban conexiones de muchos diferentes vías espinales y por lo tanto pueden ser utilizados para una diversa población de neuronas en la médula espinal y tronco encefálico. Etiquetado las neuronas en este estudio representan circuitos inervan motoneuronas piscinas relativos a la función motora del miembro posterior. Etiquetado sólido se observa en la médula espinal y tronco encefálico, incluyendo datos de alta fidelidad de cenadores dendríticos y terminales de axón. También hemos utilizado este método en estudios anteriores de la médula espinal cervical para etiqueta propiospinal y del médula oblonga reticulospinal vías25.

Este protocolo muestra la inyección de un vector viral en la médula espinal lumbar de una rata. Como se ve en la película 1, la incisión es dirigida por la identificación de la vértebra L1 situada en la última costilla. Esto se utiliza como una señal caudal para una incisión de 3-4 cm que expone la musculatura sobre la médula espinal de L1-L4. Laminectomies de los aspectos dorsales de las vértebras T11-T13 se realizan y se dirige una aguja de vidrio biselado 0.8 mm lateral de la línea media y reducido 1,5 mm en la materia gris para inyectar virus.

Protocol

Todos los procedimientos de atención quirúrgica y animales han sido aprobados por el cuidado Animal y el Comité de uso de la Universidad de Temple. 1. pre-quirúrgicos preparados Preparar el vidrio tirado agujas para inyección viral unos días antes de la cirugía usando 3,5 nanoliter capilares pipetas de vidrio diseñados para nanoliter inyectores. Tire de cada pipeta en un extractor de aguja de dos pasos según las instrucciones del fabricante para crear dos plantillas de aguja…

Representative Results

Transducción de una población robusta de unilaterales neuronas en la médula espinal y en ciertos núcleos del tronco encefálico deben resultar exitosa inyección y transporte de los vectores virales. Figura 1 muestra etiquetas estereotipadas de las neuronas y los axones de la médula espinal torácica y en la formación reticular del pontine del médula oblonga en inyección después de cuatro semanas. Significativa expresión de GFP se observa en las neuronas en la s…

Discussion

Manipulación genética de las neuronas en el cerebro y la médula espinal ha servido para destacar sensorial, motor y autonómicas vías mediante trazo fluorescente y explorar potencial de rebrote de tractos neuronales después de lesiones27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. dirigir la inyección…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por una subvención del Instituto Nacional de trastornos neurológicos y accidente cerebrovascular R01 R01NS103481 y el Hospital de Shriners for Pediatric Research otorga SHC 84051 y SHC 86000 y el Departamento de defensa (SC140089).

Materials

#10 Scalpel Blades Roboz RS-9801-10 For use with the scalpel.
1 mL Syringes Becton, Dickinson and Company 309659 For anesthetic IP injection, potential anesthetic booster shots, and antibiotic injections.
10mL Syringes Becton, Dickinson and Company 309604 For injecting saline into the animal, post-surgery.
4.0 Chromic Catgut Suture DemeTECH NN374-16 To re-bind muscle during closing.
48000 Micropipette Beveler World Precision Instruments 32416 Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.
5% Iodine Solution Purdue Products L.P. L01020-08 For use in sterilzation of the surgical site.
70% Ethanol N/A N/A For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation, and surgeon's hands during surgery, as well as all other minor maintainances of sterility.
Anesthetic (Ketamine/Xylazine Solution) Zoetis 240048 For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.
Antibiotic (Cefazolin) West-Ward Pharmaceuticals NPC 0143-9924-90 To be injected subcutaneously to prevent infection post-surgery.
Bead Sterilizer CellPoint 5-1450 To heat sterilize surgical instruments.
Bonewax Fine Science Tools 19009-00 To seal up bone in the case of bone bleeding.
Cauterizer Fine Science Tools 18010-00 To seal any arteries or veins severed during surgery to prevent excessive blood loss.
Digital Scale Okaus REV.005 For weighing the animal during surgical preparation.
Flexible Needle Attachment World Precision Instruments MF34G-5 For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.
Gelfoam Pfizer H68079 To seal up bone in the case of bone bleeding.
Glass Capillary Tubes World Precision Instruments 4878 For pulled glass needles – should be designed for nanoliter injectors.
Hair Clippers Oster 111038-060-000 For clearing the surgical site of hair.
Hemostats Roboz RS-7231 For general use in surgery.
Kimwipes Kimtech 34155 For general use in surgery.
Medium Point Curved Forceps Roboz RS-5136 For general use in surgery.
Micromanipulator with a Vernier Scale Kanetec N/A For precise targeting during surgery.
Microscissors Roboz RS-5621 For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.
Microscope with Light and Vernier Scale Ocular Leitz Wetzlar N/A Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.
MicroSyringe Pump Controller World Precision Instruments 62403 To control the rate of injection.
Nanoliter 2000 Pump Head Injector World Precision Instruments 500150 To load and inject virus in a controlled fashion.
Needle Puller Narishige PC-100 To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.
Ophthalamic Ointment Dechra Veterinary Products RAC 0119 To protect the animal's eyes during surgery.
Parafilm Bemis PM-996 To assist with loading virus into the nanoinjector.
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8) Becton, Dickinson and Company 305122 For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.
Rat Tooth Forceps Roboz RS-5152 For griping spinous processes.
Red Oil N/A N/A To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.
Retractors Roboz RS-6510 To hold open the surgical wound.
Rimadyl Tablets Bio Serv MP275-050 For pain management post-surgery.
Rongeurs Roboz RS-8300 To remove muscle from the spinal column during surgery.
Scalpel Blade Handle Roboz RS-9843 To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.
Scissors Roboz RS-5980 For general use in surgery.
Stainless Steal Wound Clips CellPoint 201-1000 To bind the skin of the surgical wound during closing.
Staple Removing Forceps Kent Scientific INS750347 To remove the staples, should they be applied incorrectly.
Sterile Cloth Phenix Research Products BP-989 To provide a sterile surface for the operation.
Sterile Cotton-Tipped Applicators Puritan 806-WC To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.
Sterile Gauze Covidien 2146 To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.
Sterile Saline Baxter Healthcare Corporation 281324 For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.
Surgical Gloves N/A N/A For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.
Surgical Heating Pad N/A N/A For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.
Surgical Microscope N/A N/A For enhanced visualization of the surgical wound.
Surgical Stapler Kent Scientific INS750546 To apply the staples.
T/Pump Heat Therapy Water Pump Gaymar TP500C To pump warm water into the water convection warming pad.
Water Convection Warming Pad Baxter Healthcare Corporation L1K018 For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.
Weighted Hooks N/A N/A To hold open the surgical wound.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
  2. Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
  3. Brichta, A. M., Grant, G. Cytoarchitectural organization of the spinal cord. The rat nervous system. Vol. 2, hindbrain and spinal cord. , (1985).
  4. Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. Projections from the brain to the spinal cord in the mouse. Brain Structure & Function. 215 (3-4), 159-186 (2011).
  5. Rexed, B. The cytoarchitectonic organization of the spinal cord in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 96 (3), 414-495 (1952).
  6. Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-gold: A new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
  7. Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
  8. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Atlas of the rat spinal cord. The spinal cord. , 238-306 (2009).
  9. Brandt, H. M., Apkarian, A. V. Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey. Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).
  10. Geed, S., van Kan, P. L. E. Grasp-based functional coupling between reach- and grasp-related components of forelimb muscle activity. Journal of Motor Behavior. 49 (3), 312-328 (2017).
  11. Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).
  12. Steward, O., Zheng, B., Banos, K., Yee, K. M., et al. Response to: Kim et al., "axon regeneration in young adult mice lacking nogo-A/B." neuron 38, 187-199. Neuron. 54 (2), 191-195 (2007).
  13. Brown, B. D., et al. A microRNA-regulated lentiviral vector mediates stable correction of hemophilia B mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
  14. Lo Bianco, C., et al. Lentiviral vector delivery of parkin prevents dopaminergic degeneration in an alpha-synuclein rat model of parkinson’s disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (50), 17510-17515 (2004).
  15. Malik, P., Arumugam, P. I., Yee, J. K., Puthenveetil, G. Successful correction of the human cooley’s anemia beta-thalassemia major phenotype using a lentiviral vector flanked by the chicken hypersensitive site 4 chromatin insulator. Annals of the New York Academy of Sciences. 1054, 238-249 (2005).
  16. Pawliuk, R., et al. Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy. Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).
  17. Wang, G., et al. Feline immunodeficiency virus vectors persistently transduce nondividing airway epithelia and correct the cystic fibrosis defect. The Journal of Clinical Investigation. 104 (11), R55-R62 (1999).
  18. Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. The red nucleus and the rubrospinal projection in the mouse. Brain Structure & Function. 217 (2), 221-232 (2012).
  19. Abdellatif, A. A., et al. delivery to the spinal cord: comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems. Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2010).
  20. DePolo, N. J., et al. VSV-G pseudotyped lentiviral vector particles produced in human cells are inactivated by human serum. Molecular Therapy. 2 (3), 218-222 (2000).
  21. Higashikawa, F., Chang, L. Kinetic analyses of stability of simple and complex retroviral vectors. Virology. 280 (1), 124-131 (2001).
  22. Hirano, M., Kato, S., Kobayashi, K., Okada, T., Yaginuma, H., Kobayashi, K. Highly efficient retrograde gene transfer into motor neurons by a lentiviral vector pseudotyped with fusion glycoprotein. PLoS One. 8 (9), e75896 (2013).
  23. Kato, S., et al. A lentiviral strategy for highly efficient retrograde gene transfer by pseudotyping with fusion envelope glycoprotein. Human Gene Therapy. 22 (2), 197-206 (2011).
  24. Kato, S., et al. Selective neural pathway targeting reveals key roles of thalamostriatal projection in the control of visual discrimination. The Journal of Neuroscience. 31 (47), 17169-17179 (2011).
  25. Sheikh, I. S., Keefe, K. M., et al. Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits. Frontiers in Neural Circuits. 12, 60 (2018).
  26. Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. NeuroImage. 68, 22-29 (2013).
  27. Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. The Journal of Neuroscience. 27 (22), 6068-6078 (2007).
  28. Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2923-2932 (2006).
  29. Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration. PLoS One. 9 (2), e87447 (2014).
  30. Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: Use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
  31. Filli, L., et al. Bridging the gap: A reticulo-propriospinal detour bypassing an incomplete spinal cord injury. The Journal of Neuroscience. 34 (40), 13399-13410 (2014).
  32. Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. The Journal of Gene Medicine. 14 (1), 20-34 (2012).
  33. Smith, G. M., Onifer, S. M. Construction of pathways to promote axon growth within the adult central nervous system. Brain Research Bulletin. 84 (4-5), 300-305 (2011).
  34. Morcuende, S., Delgado-Garcia, J. M., Ugolini, G. Neuronal premotor networks involved in eyelid responses: Retrograde transneuronal tracing with rabies virus from the orbicularis oculi muscle in the rat. The Journal of Neuroscience. 22 (20), 8808-8818 (2002).
  35. Ugolini, G. Specificity of rabies virus as a transneuronal tracer of motor networks: Transfer from hypoglossal motoneurons to connected second-order and higher order central nervous system cell groups. The Journal of Comparative Neurology. 356 (3), 457-480 (1995).
  36. Gelderd, J. B., Chopin, S. F. The vertebral level of origin of spinal nerves in the rat. The Anatomical Record. 188 (1), 45-47 (1977).
  37. Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. 73, e50313 (2013).
  38. Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. Journal of Visualized Experiments. 53, e2834 (2011).
  39. Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Human Gene Therapy. 22 (9), 1129-1135 (2011).
  40. Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Current Gene Therapy. 5 (4), 387-398 (2005).
  41. Reed, W. R., Shum-Siu, A., Onifer, S. M., Magnuson, D. S. Inter-enlargement pathways in the ventrolateral funiculus of the adult rat spinal cord. Neuroscienze. 142 (4), 1195-1207 (2006).
  42. Mao, X., Schwend, T., Conrad, G. W. Expression and localization of neural cell adhesion molecule and polysialic acid during chick corneal development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (3), 1234-1243 (2012).
  43. Charles, P., et al. Negative regulation of central nervous system myelination by polysialylated-neural cell adhesion molecule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (13), 7585-7590 (2000).
  44. Tervo, D. G., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
  45. Tohyama, T., et al. Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).
  46. Liu, Y., et al. A sensitized IGF1 treatment restores corticospinal axon-dependent functions. Neuron. 95 (4), 817-833 (2017).
  47. Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).

Tags

Lentiviral VectorSpinal CordMotor PathwaysViral VectorGenetic MaterialNeural CircuitsDirect InjectionL1 To L4 Spinal LevelsMicromanipulatorAnesthetized RatSkin IncisionSpinous ProcessesRat Tooth Forceps

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Keefe, K. M., Junker, I. P., Sheikh, I. S., Campion, T. J., Smith, G. M. Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord. J. Vis. Exp. (145), e59160, doi:10.3791/59160 (2019).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image