Directe inspuiting van een lentivirale Vector hoogtepunten meerdere Motor trajecten in het ruggenmerg Rat

Virale vectoren zijn belangrijke biologische hulpmiddelen die genetisch materiaal kunnen introduceren in cellen om te compenseren voor defecte genen, upregulate belangrijke groei eiwitten of marker eiwitten die wijzen op de structuur en de synaptische Connecties van vervaardiging hun doelstellingen. Dit artikel richt zich op directe injectie van een zeer efficiënte retrogradely vervoerbare lentivirale vector in het ruggenmerg rat om te benadrukken grote motor trajecten met fluorescerende tracering.  Deze methode is ook zeer geschikt voor axonale regeneratie en hergroei studies te introduceren van proteïnen van belang in diverse populaties van neuronen en heeft geweest tweedehands voor zwijgen neuronen voor functionele toewijzing studies^1,2.

Veel van de anatomische details voor spinale motor trajecten werden toegelicht door middel van directe inspuiting studies met klassieke traceurs zoals BDA en fluoro-goud^3,4,,^5,,^{6,7 , 8}. deze verklikstoffen worden beschouwd als gouden standaard maar wellicht bepaalde nadelen zoals opname door beschadigde axonen of axonen in de passage in de witte stof rondom een injectie site^9,10,11 . Dit kan kan leiden tot onjuiste interpretaties van traject connectiviteit en een nadeel in regeneratie studies waar de kleurstof absorptie door beschadigd of afgehakte axonen voor het regenereren van de vezels tijdens latere analyse¹²kon vergissen.

Lentivirale vectoren zijn populair in gen therapie onderzoeken, zoals zij stabiele expressie in neuronale populaties^{13,14,15,16,17,18 leveren ,19}. Echter, traditioneel verpakte lentivirale vectoren kunnen hebben beperkte retrograde vervoer en kan leiden tot immuunsysteem reactie wanneer gebruikt in vivo^4,20,21. Een uiterst efficiënte retrograde vervoer vector genoemd HiRet opgesteld door Kato et al. door aanpassing van de virale envelop met een rabiës virus glycoproteïne maken een hybride-vector die retrograde vervoer^{22,23 verbetert}.

Retrograde tracering introduceert een vector in de synaptische ruimte van een target neuron, waardoor het te worden in beslag genomen door de axon van die cel naar de cel lichaam vervoerd. Succesvolle vervoer van HiRet is gebleken uit de neuronale synapsen in de hersenen van muizen en primaten^23,24 en de spier in motorische neuronen²². Dit protocol toont injectie in de lumbale ruggemerg, specifiek gericht zijn op de synaptische terminals van propriospinal interneuronen en hersenstam neuronen. PNs ontvangen van verbindingen van vele verschillende spinale routes en kunnen dus worden gebruikt om een diverse bevolking van neuronen in het ruggenmerg en hersenstam richten. Gelabelde neuronen in deze studie vertegenwoordigen schakelingen innervating motor neuron zwembaden met betrekking tot stuk motor functie. Robuuste labeling is te zien in het ruggenmerg en hersenstam, met inbegrip van high-fidelity details van dendritische arbors en axon terminals. Wij hebben deze methode ook gebruikt in eerdere studies binnen het cervicale ruggenmerg aan het label propriospinal en hersenstam reticulospinal trajecten²⁵.

Dit protocol toont injectie van een virale vector in de lumbale ruggemerg van een rat. Zoals te zien in de film 1, wordt de incisie wordt gericht door het identificeren van de L1 wervel attractiepark van de laatste rib. Dit wordt gebruikt als een caudal mijlpaal voor een incisie voor 3-4 cm die de daaraan gehechte spiermassa over het ruggenmerg L1-L4 bloot. Laminectomies van de dorsale aspecten van de wervels T11-T13 worden uitgevoerd en een schuine glazen naald is gericht 0.8 mm lateraal van de middellijn en verlaagde 1,5 mm diep in de grijze stof te injecteren van virus.