Un método versátil para el montaje de Arabidopsis las hojas para la proyección de imagen de Time-lapse Intravital

Nota: Es importante para evitar el sueño movimiento de la hoja de vida de las muestras durante la proyección de imagen de Time-lapse. Para minimizar el estrés mecánico en las hojas, es necesaria fijación suave de las hojas. Sólo las muestras de hojas adecuadamente preparados producen Time-lapse imágenes adecuadas para distintos análisis de la imagen. Un protocolo de uso de plantas transgénicas de Arabidopsis expresando la fusión YFP-NLS bajo el control del promotor del gen PR1 (pPR1-YFP-NLS plantas) y Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 cepa (avrRpt2) (Pst_a2) se describe a continuación como ejemplo. 1. preparación de las plantas y los patógenos Rellenen una charola de plástico celular (Tabla de materiales) con suelo esterilizado. Siembre una semilla transgénica de Arabidopsis por célula (figura 1A). Transferencia de la bandeja a un cuarto de crecimiento mantenido a 23 ° C y crecen las plantas bajo luz blanca continua durante 2-3 semanas. Dos días antes de la inoculación del patógeno, la raya Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 avrRpt2 tensión (Pst_a2) de un stock de glicerol en NYG medio (peptona 5 g/L, extracto de levadura 3 g/L, glicerol 20 mL/L, agar bacteriológico 15 g/L, pH 7.0) que contiene 100 mg/L rifampicina y 50 mg/L de kanamicina e incubar a 28 ° C durante 48 h. Cosecha de las células bacterianas que aparecen en la superficie del medio con puntas de plástico, transferir a un tubo de plástico que contenía 10 mM de MgCl2y resuspender. Medir la densidad óptica (OD) de la solución a 600 nm (OD600). Ajustar la concentración celular final de células bacterianas a unidades de formación de colonias (UFC) de 108 / mL, que normalmente corresponde a OD600 = 0,211. 2. inoculación del patógeno Con cuidado corta un tapón de celda que contiene una planta de 2-3 semanas de edad sin dañar la planta. Encuentra la celda en una charola de celda vacía (2 x 2 células son suficientes) para mantener un buen equilibrio (figura 1B). Seleccione una hoja visiblemente saludable para la inoculación. En general, el tercero, cuarto y quinto deja (#3, #4 y #5, respectivamente, en la figura 1C) de la parte inferior de la planta son fáciles de manejar. Uso hojas en la misma posición en un conjunto de experimentos para mejor reproducibilidad. Agua del suelo con la planta antes de la inoculación para la proyección de imagen de lapso de tiempo a largo plazo. Opcionalmente, en el caso de análisis de promotores sensible al estrés como pPR1, para asegurar que las plantas no son naturalmente destacó, examinar las hojas bajo un estereomicroscopio de fluorescencia antes de la inoculación del patógeno para verificar la ausencia de señal YFP. Excluir deja señal YFP de muestra del experimento. Guantes desechables latex antes de la infiltración para evitar el contacto directo con el patógeno. Cuidadosamente usando una jeringa de plástico sin aguja de 1 mL, infiltrarse en el lado abaxial de la hoja con la suspensión bacteriana (108 UFC/mL)11 (figura 1D). Inoculación de una pequeña porción en la mitad de la hoja permite una buena visualización de actividad pPR1 ; el área infiltrado se hace visible como color en comparación con las restantes hojas verde más oscuro. Ser extremadamente cuidadoso para no causar daños mecánicos a la hoja durante la infiltración.Nota: Asegúrese de que estén todos los espacios intercelulares en el área infiltrado (verticalmente) satisfecho con la suspensión del agente patógeno; de lo contrario, el dominio PCD serán difícil de visualizar bajo el estereomicroscopio fluorescente. Esto puede confirmarse simplemente por terminación de verde oscuro en la zona infiltrada. Absorber el exceso de suspensión bacteriana de la zona que rodea la sección infiltrada de la hoja infiltrada con una toalla de papel suave. 3. montaje de la hoja inoculada Inmediatamente después de la inoculación, fijar un portaobjeto en la bandeja de plástico con cinta quirúrgica (Tabla de materiales) tal que la hoja infiltrada está situada en el centro de la diapositiva de cristal. Asegúrese de que la hoja inoculada es totalmente colocada en el portaobjetos de cristal (figura 2A). Preparar dos capas de cinta plástica (en el caso de cinta espesor de 0,2 mm, véase Tabla de materiales) y cortado en dos piezas (figura 2B, piezas 1 y 2) para adaptarse a los espacios a lo largo del pecíolo de la hoja infiltrada. Organizar la duración de estas dos piezas, indicado con una flecha de dos puntas en la figura 2B, para caber en la longitud de la flecha de dos puntas que se muestra en la figura 2A.Nota: Cortando una esquina de cada una de las dos piezas ayuda a evitar daños a la hoja (figura 2B, puntas de flecha; véase también el paso 3.4 a continuación). Cualquier tipo de cinta de plástico con espesor similar es conveniente para hacer un puente sobre el peciolo. La rigidez de la cinta de plástico es importante para facilitar el manejo durante el procedimiento que se describe a continuación. Usando un par de Pinzas finas, pegar piezas de cinta 1 y 2 en ambos lados del pecíolo que alineen las esquinas de corte de cada pieza con la base de la hoja (figura 2C). Asegúrese de que las piezas de la cinta no toquen la cuchilla, hoja o pecíolo.Nota: Estas piezas de cinta de plástico de doble capa en la base de la hoja actúan como espaciadores y evitar el estrés físico en el peciolo durante el montaje. Una pieza adicional de dos capas de cinta plástica (figura 2B, pieza 3) se preparan para ajustarse al tamaño de la flecha de dos puntas en la figura 2B y pegarlo en la parte superior las piezas de la cinta 1 y 2 para formar un puente sobre el peciolo ( Figura 2D, E). Tenga sumo cuidado de no coger la hoja pecíolo y hoja directamente entre los trozos de cinta en las posiciones indicadas con flechas en la figura 2D, E. Suavemente se pegan un pedazo pequeño de cinta quirúrgica (figura 2F, pieza 4) en la diapositiva de cristal encima de la punta de la hoja para que la hoja se fija muy suavemente en el portaobjetos de cristal. Sólo Presione firmemente hacia abajo la parte de la cinta quirúrgica directamente tocando el portaobjetos de cristal (figura 2F, área se indica con una línea roja discontinua), no la otra parte que cubría la hoja. Suavemente pegar otro trozo pequeño de cinta quirúrgica (figura 2G, pieza 5) en la frontera del pecíolo y cinta plástica piezas (1, 2 y 3) para que el peciolo se fija muy suavemente sobre el portaobjetos de vidrio y cinta de plástico piezas. Sólo Fije firmemente la pieza de la cinta quirúrgica directamente tocando el portaobjetos de vidrio portaobjetos de vidrio y piezas de plástico de la cinta (figura 2G, área se indica con una línea roja discontinua), no la otra parte que el peciolo. Impiden el movimiento en el campo de visión del microscopio usando puntas de pipeta de 200 μl (figura 2H) hojas vecinas. Inserte las puntas de la pipeta en el suelo para sostener suavemente las hojas vecinas de la hoja infiltrada. Tenga cuidado de no insertar las puntas demasiado profundas en el suelo para evitar daños en posible raíz.Nota: La planta preparada está lista para la proyección de imagen de Estereomicroscopio de la fluorescencia. 4. microscopio Observación de Time-lapse Encender el fluorescente Estereomicroscopio.Nota: Aquí, un estereomicroscopio automatizada equipada con una alta sensibilidad monocromo de 1,4 megapíxeles cámara digital en modo de 12 bits se utiliza (Tabla de materiales). El microscopio debe colocarse en un cuarto oscuro con una unidad de aire acondicionado o en un gabinete oscuro con ventilación adecuada para mantener la temperatura a 23 ° C durante la proyección de imagen de Time-lapse. Establecer la planta en el espacio sobre el objetivo de Estereomicroscopio para la proyección de imagen. Establecer los parámetros para la proyección de imagen de Time-lapse (ver ejemplos en tabla 1). Asegúrese de que a pasos de programa por exposición a la luz durante el intervalo de Time-lapse de imágenes ya que la luz tiene un gran impacto en planta inmunidad12. Utilizar el filtro convencional de YFP (excitación 500-520 nm; emisión 540-580 nm) para visualizar la señal YFP. Utilizar el filtro rojo de Texas (TXR) (excitación 540-580 nm; pase largo de emisión 610 nm) para visualizar la autofluorescencia de la clorofila por lo que el dominio de la PCD es visible como una zona oscura (sin autofluorescencia) rodeada de YFP-positive células capas9 (figura 3 A). Utilice la configuración convencional campo epi-brillante para medidas de exposición a la luz adicional.Nota: Antes del experimento, medir la potencia de la fuente de luz brillante epi y ajustar el nivel de condición del crecimiento propio de la planta. Ejecute el programa de lapso de tiempo. Para la observación a largo plazo durante varios días, considerar riego la planta adecuadamente, por ejemplo, durante la exposición a la luz. Después de la adquisición de la imagen, omitir canales extras utilizados para la exposición a la luz en los intervalos (que corresponde a los canales 3-8 en la tabla 1) desde el conjunto de datos. Analizar los datos con diversos métodos, como el análisis de regiones de interés (ROI), utilizando software de análisis de imagen diferente como Fiji9.