Intravital 시간 경과 영상에 대 한 애기 를 장착 하는 다양 한 방법을 나뭇잎합니다
Summary
우리는 시간의 연장된 기간 동안 형광 라이브 이미징 애기 thaliana 잎을 수행 하기 위한 간단 하 고 다재 다능 한 방법 보고. 우리는 식물 면역 반응의 spatiotemporal 이해에 대 한 예를 들어 면역 관련 발기인의 통제 형광 성 취재 원 유전자를 표현 하는 유전자 변형 애기 식물을 사용 합니다.
Abstract
식물 면역 반응 게놈 넓은 transcriptional 재프로그래밍과 관련 된 감염의 사이트에 시작 됩니다. 따라서, 공간에 그리고 일시적으로 면역 반응 통제 된다. 통제는 자동된 형광 현미경과 함께에서 면역 관련 발기인의 형광 유전자를 사용 하 여 식물의 spatiotemporal 규정을 이해 하는 간단한 방법입니다. 다양 한 다양 한 intravital 형광 이미징 실험에 사용 된 루트 조직, 대조적으로 발생 하는 공 수 미생물 감염의 배열을 잎 조직에 대 한 몇 가지 형광 라이브 이미징 예제 존재 한다. 따라서, 우리는 시간의 연장된 기간 동안 라이브 셀 이미징에 대 한 애기 thaliana 식물의 잎을 거치 하는 간단한 방법을 개발 했다. 우리는, Pathogenesis-Related 1 (방어 관련 마커 유전자의 발기인의 통제 핵 지 방화 신호 (NLS)에 노란 형광 성 단백질 (YFP) genefused을 표현 하는 유전자 변형 애기 식물 사용 P r 1)입니다. 우리 슈 도모 나 스 syringae pv와 유전자 변형 잎에 침투. 토마토 DC3000 (avrRpt2) (Pst_a2)를 변형 하 고 수행 하는 자동된 형광 stereomicroscope를 사용 하 여 40 h의 총 YFP 신호의 vivo에서 시간 경과 영상. 이 방법은 식물 면역 반응에 대 한 연구 뿐만 아니라 다양 한 발달 이벤트 및 잎 조직에서 발생 하는 환경 응답의 분석에 활용할 수 있습니다.
Introduction
식물 면역 반응을 포함 한 동적 transcriptional 프로그래밍 여러 전사에 의해 규제 phytohormones1뿐만 아니라 요인. Transcriptome 데이터의 축적은 식물 면역 시스템에 정보를 수집 하기 위한 기회를 제공 합니다: 예를 들어 네트워크 구조 신호 폭포2. 그러나, 식물의 공간과 일시적인 역동성의 우리의 지식을 제한3,,45여전히 남아 있다.
이전 학문에서는, 방어 관련 유전자 발현의 spatiotemporal 규정은 되어 주로 분석 제자리 교 잡 및 β-glucuronidase (거 스) 기자 분석 결과6,,78을 사용 하 여. 이러한 메서드를 현장에서의 다양 한 유전자의 transcriptional 활성화 시각화를 사용. 그러나,이 절차의 표본, 화학 기정을 요구 하 고 따라서 모든 시간적인 정보 손실 될. 생물 학적 이벤트, 면역, 시간이 지남에 진행 상황 등. 기자로 서 luciferase 사용 하 여 관심3의 발기인의 일시적인 역동성의 캡처 수 있게 되었습니다. 그러나, luciferase 기반 분석 결과 비싼 기판 및 고감도 검출기 필요합니다. 간단한 절차를 사용 하 여 식물 면역 응답의 spatiotemporal 측면에 대 한 우리의 이해를 높이기 위해 유전자 변형 애기 thaliana 생성 노란 형광 성 단백질 (YFP)를 표현 하는 식물 유전자 융합 하는 핵 지 방화 신호 (NLS YFP) Pathogenesis-Related 1 (PR1)9, 방어 관련 마커 유전자의 발기인의 통제. 우리 프로그램 된 세포 죽음 (PCD), 종종 이펙터 트리거 면역 (ETI), 특정 병원 체 감염9 에 의해 유도 된 식물의 형태 발생의 과정을 잡으려고 엽록소 autofluorescence, 살아있는 세포의 표식 사용 , 10.와 같은 개체를 자유롭게 이동에 형광 신호 강도의 시간적 역학 모니터링 애기 잎 생활, 복잡 한 이미지 프로세싱 소프트웨어 자체 내장 또는 사용 가능한 상업적으로 필요 합니다. 또는 이동에서 견본을 방지 하는 것은 문제를 해결 하는 간단한 방법입니다. 여기, 우리는 장착 된 자동된 형광 stereomicroscope 아래 장기 관찰에 대 한 유전자 변형 애기 식물의 잎을 생활에 대 한 다양 하 고 간단한 방법을 개발. 메서드를 몇 일 동안 토양 재배 그대로 공장 내에서 역학 나뭇잎 발기인을 캡처할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 우리 애기 잎 자동된 형광 stereomicroscope를 사용 하 여 장기 관찰에 대 한 관심의 발기인의 통제 형광 성 취재 원 유전자를 표현 하는 생활을 탑재 하는 간단한 방법을 보고 합니다. 루트 조직;에서 형광 기자의 시간 경과 영상 자주 수행 그러나, 몇 가지 유사한 연구 잎 조직에서 실시 되었습니다. 잎은 뿌리는 종종 매장 하 고 탄탄 한 천 매체에 고정 공간에서 자유롭게 움직일 수 있기 때문에 가장 높습니다.
이 보고서에서 우리는 Pst_a2에 의해 유도 된 ETI 중 pPR1 활동의 spatiotemporal 역학에 집중 했다. 위에서 자세히 설명 하는 잎의 부드러운 고정 뿐 명확 하 게 발기인 활성화 및 PCD와 같은 휴대 전화 이벤트의 spatiotemporal 역학을 시각화 하는 것이 중요입니다. PPR1 활동 및 PCD 셀 사이의 구별이 날카로운 침투 지역에 세포 공간의 모든 완전히 병원 체 서 스 펜 션으로 가득 확인 (단계 2.4 참조). 이 때 중요 한 때문에 이러한 현미경 표본 동일한 세로 위치에 따라 모든 감지 신호 캡처 넓은 필드 형광 스테레오 현미경을 사용 하 여. 위 또는 아래 셀 PCD 도메인에 살아남은 세포에서 엽록소 autofluorescence 쉽게 아무 autofluorescence를 전시 하는 죽은 세포를 마스크 합니다. 이것은 또한 YFP 신호에 대 한 사실입니다.
시간 경과 영상에 대 한 조건을 신중 하 게 다른 실험 조건 하에서 몇몇 예비 실험을 통해 설립 될 필요가 있다. 시간 경과 영상에 대 한 매개 변수는 현미경 시스템, 유전자 변형 식물, 균. 등 여러 가지 요인에 따라 달라 집니다. 이러한 매개 변수를 얻으려면, 우리는 먼저 7 hpi, pPR1의 초기 활성화와 거의 일치 한다에 침투 잎 YFP 신호 강도 대 한 다양 한 노출 시간 분석. 5 s 노출이이 연구에 사용 된 stereomicroscope와 YFP 신호 캡처에 대 한 적절 한 결정 했다. 유사한 테스트 엽록소 autofluorescence 이미징에 대 한 수행 했습니다. 3 분 간격 사이의 빛에는 시료의 노출 시간 경과 이미징 프로그램으로 최대 노출 시간으로 보통 밝은 필드 이미징으로 짜여졌다. 우리의 시스템 (자료 테이블)를 사용 하 여 2.5 분 YFP, TXR, 및 밝은 필드 이미징 있다 수 있었습니다. 이 제약 조건은 3 분 간격을 선택에 대 한 기본 이유 이었다. 다음으로, 우리는이 시간 경과 상태 공장 샘플에 명백한 손상 발생 하 고 pPR1 (그림 3B, C)의 소성 가벼운 스트레스 관련 활성화를 유도 하지 않았다 확인 했다. 이것이 연구에 사용 된 프로그램의 개발을 했다. 따라서, 형광 영상의 3 분 간격으로 Pst_a2동안 pPR1 역학을 캡처에 대 한 충분 한 간주 되었다-ETI9중재.
발기인 기자 구문, NLS, 융합 형광 기자와 특히 이용 되었습니다 많은 그룹 및 연구 기관;에서 쉽게 사용할 수 있습니다. 우리는 과연 그 외 여러분 에 의해 구문 사용 13. 따라서, 여기에 설명 된 프로토콜 경우 사용할 수 있습니다 잎 조직 검사 모든 식물 생물학 연구에 적절 한 유전자 변형 식물 사용할 수 있습니다. 우리의 간단 하 고 쉬운 프로토콜에서 발생 하는 모든 생물학 사건의 spatiotemporal 역학을 분석 하 고 싶어 하는 연구자에 대 한 좋은 기회 나뭇잎, 면역 반응 등을 제공 합니다. 그것은 그럴듯한 테이프 조각을 사용 하 여 우리의 메서드는 표본에 약간의 물리적 스트레스를 유도입니다. 그러나,이 문제는 (그림 3C) 실험에서 모의 치료 등 적절 한 긍정적이 고 부정적인 컨트롤을 포함 하 여 제어할 수 있습니다. 실험 조건을 더 수정 하 고 다른 조건 하에서 이러한 컨트롤을 분석 하 여 최적화 될 수 있습니다.
최근 몇 년 동안, 이미징 기기 및 기술의 급속 한 발전 생물학 이벤트의 복잡 한 spatiotemporal 측면에서 연구자의 관심을 자극 했다. 어떤 이미징 분석에 적절 한 장착 및 표본의 고정 가장 중요 한 문제 들이다. 장착 생활 애기 단풍이 연구 개발의 간단 하 고 다양 한 방법은 적용 하 고 다양 한 이미징 실험에 대 한 최적화 된 수 있습니다.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 일본 과학 기술 기관에 의해 지원 되었다 [S.B., N.N.에 ERATOJPMJER1502에 PRESTO117665] (연구비 연구 활동 시작 [S.B.에 22880008] 및 젊은 과학자 (B) [대 한 과학의 승진에 대 한 일본 사회에 의해 23780040 S.B.])입니다. 우리가 우수한 기술 지원, pBGYN 벡터를 제공 하는 Pst_a2 , 긴장과 T. Demura를 제공 하기 위한 제이 파커에 대 한 A. 자키, Y. 스즈키, Y. Sugisawa, E. Betsuyaku 감사 합니다.
Materials
| Bacto Agar | BD biosciences | 214010 | |
| Bacto Protease Peptone No. 3 | BD biosciences | 211693 | |
| Bacto Yeast Extract | BD biosciences | 212750 | |
| BM2 soil | Berger | ||
| Glycerol | nacalai tesque | 17017-35 | |
| Kanamycin sulfate | Wako | 113-00343 | |
| Leica M205FA with DFC365FX, LED_MCI and Leica EL6000 (Las X software-regulated) | Leica Microsystems | Yellow fluorescent protein (YFP) and Texas Red (TXR) filters installed | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Wako | 135-00165 | |
| Micro Slide Glass (Size: 76 mm × 26 mm, Thickness: 1.0–1.2 mm) | MATSUNAMI | S1112 | |
| Micropore Surgical Tape (1.25 cm × 9 m) | 3M | 1530-0 | |
| Needleless 1 ml plastic syringe | Terumo | SS-01T | |
| Plastic cell plug tray (cell size: 44 mm × 44mm × 44 mm) | Tanaka sangyo, Japan | htray-bk72 | Any tray with similar sized cells can be used |
| Rifampicin | nacalai tesque | 30259-81 | |
| Plastic Tape (0.2 mm thick × 19 mm wide × 10 m long) | Yamato | No0200-19-1 | Any plastic/vinyl tape with similar thickness can be used |
Riferimenti
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