Eine vielseitige Methode für die Montage von Arabidopsis verlässt für intravitalen Zeitraffer Aufnahmen
Summary
Wir berichten über eine einfache und vielseitige Methode zur Durchführung von fluoreszierenden live-Imaging von Arabidopsis Thaliana Blätter über einen längeren Zeitraum hinweg. Wir verwenden eine transgene Arabidopsis -Pflanze mit dem Ausdruck einer fluoreszierenden Reporter-gen unter der Kontrolle von einer Immunität im Zusammenhang mit Promoter als Vorbild für die räumlich-zeitliche Verständnis der Pflanze Immunantworten.
Abstract
Die Pflanze Immunantwort eine genomweite transkriptionelle Neuprogrammierung zugeordnet wird am Ort der Infektion eingeleitet. Somit ist die Immunantwort räumlich und zeitlich geregelt. Die Verwendung von fluoreszierenden gen unter der Kontrolle von einer Immunität im Zusammenhang mit Promoter in Kombination mit einer automatisierten Fluoreszenz-Mikroskopie ist eine einfache Möglichkeit, räumlich-zeitliche Regelung der Anlage Immunität zu verstehen. Im Gegensatz zu den Wurzel-Geweben, die für eine Reihe von verschiedenen intravitalen fluoreszierende bildgebenden Experimenten verwendet wurden, gibt es fluoreszierende live-Imaging Beispiele für die Blatt-Gewebe, die ein Array von airborne mikrobielle Infektionen auftreten. Daher entwickelten wir eine einfache Methode um Blätter von Arabidopsis Thaliana Pflanzen für das live Cell Imaging über einen längeren Zeitraum hinweg zu montieren. Wir verwendeten transgenen Arabidopsis -Pflanzen mit dem Ausdruck der gelben fluoreszierenden Proteins (YFP) Genefused mit dem nuklearen Lokalisierung Signal (NLS) unter der Kontrolle der Förderer der Verteidigung bezogene Markergen, Pathogenesis-Related 1 ( PR1). Wir haben ein transgenes Blatt mit Pseudomonas Syringae pv infiltriert. Tomaten DC3000 (avrRpt2) Stamm (Pst_a2) und in-vivo Zeitraffer Bildgebung des YFP Signals für eine Gesamtmenge von 40 h mit einer automatisierten Fluoreszenz Stereomikroskop durchgeführt. Diese Methode kann nicht nur für Studien zur Pflanze Immunantworten, sondern auch für die Analyse von verschiedenen Entwicklungsstörungen Ereignisse und Umwelt Reaktionen auftreten im Blatt Gewebe verwendet werden.
Introduction
Pflanze Immunantwort beinhaltet eine dynamische transkriptionelle Umprogrammierung durch mehrere Transkription reguliert Faktoren sowie Phytohormone1. Die Anhäufung von Transkriptom Daten bietet Möglichkeiten zum Sammeln von Informationen auf das Immunsystem der Pflanze: zum Beispiel die Netzwerkstruktur der Signalisierung Kaskaden2. Unser Wissen über die räumliche und zeitliche Dynamik der Pflanze Immunität bleibt jedoch immer noch nur3,4,5.
In früheren Studien wurde meist raumzeitlichen Regulation der Genexpression im Zusammenhang mit der Verteidigung mittels in-situ Hybridisierung und β-Glucuronidase (GUS) Reporter Assay6,7,8analysiert. Diese Methoden ermöglichen es uns, die transkriptionelle Aktivierung von verschiedenen Genen des Interesses an Ort und Stelle zu visualisieren. Jedoch diese Verfahren erfordern chemische Fixierung der Proben, und somit zum Verlust aller zeitlichen Informationen führen. Biologische Ereignisse, z. B. Immunität, Fortschritte im Laufe der Zeit. Die Verwendung von Luciferase als Reporter hat die Erfassung der zeitlichen Dynamik des Veranstalters von Interesse3aktiviert. Luciferase-basierten Test erfordert jedoch eine teure Substrat und hochempfindlichen Detektoren. Um unser Verständnis der räumlich-zeitliche Aspekte der Pflanze Immunantwort mit Hilfe eines einfachen Verfahrens zu erhöhen, generierten wir transgene Arabidopsis Thaliana Pflanzen, die gelb fluoreszierenden Proteins (YFP) gen verschmolzen die nukleare Lokalisierung Signal (YFP-NLS) unter der Kontrolle der Förderer der Verteidigung-bezogenen Marker-gen, Pathogenesis-Related 1 (PR1)9. Wir verwendeten Chlorophyll Autofluoreszenz, eine Markierung von lebenden Zellen, den Prozess des programmierten Zelltod (PCD), erfassen die tritt häufig während der Effektor ausgelöst Immunität (ETI), eine Form der Pflanze Immunität induziert durch spezifische Erreger Infektion9 , 10. Überwachung die zeitliche Dynamik der Fluoreszenz Signalintensität in frei bewegender Objekte, wie z. B. Arabidopsis Blätter Leben, erfordert eine komplexe Bildverarbeitungs-Software entweder selbst gebaut oder verfügbar im Handel. Alternativ ist das verhindern des Verschiebens von Proben eine einfache Methode, um das Problem zu lösen. Hier haben wir eine vielseitige und einfache Methode für die Montage, die Blätter einer transgenen Pflanze der Arabidopsis zur Dauerbeobachtung unter einem automatisierten Fluoreszenz Stereomikroskop Leben entwickelt. Die Methode ermöglicht es uns, den Projektträger zu erfassen, die Dynamik innerhalb der intakten Pflanze Boden gewachsen in ein paar Tagen verlässt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier berichten wir über eine einfache Methode, eine lebendige Arabidopsis -Blatt mit dem Ausdruck einer fluoreszierenden Reporter-gen unter der Kontrolle eines Promotors des Interesses für Langzeit-Beobachtung mit einem automatisierten Fluoreszenz Stereomikroskop zu montieren. Time-Lapse Bildgebung eines fluoreszierenden Reporter wurde häufig in Wurzel Gewebe durchgeführt; in Blatt Geweben wurden jedoch nur wenige ähnliche Studien durchgeführt. Dies ist sehr wahrscheinlich, weil die Blätter in der Lage sind, frei im Raum bewegen, während Wurzeln sind oft vergraben und in festen Agar Medium fixiert.
In diesem Bericht konzentrierten wir uns auf die räumlich-zeitliche Dynamik der pPR1 Aktivität während ETI induziert durch Pst_a2. Neben der sanfte Fixierung des oben beschriebenen Blattes ist es wichtig, die räumlich-zeitliche Dynamik der zelluläre Ereignisse wie Veranstalter Aktivierung und PCD deutlich sichtbar zu machen. Die Unterscheidung zwischen Zellen zeigen pPR1 Aktivität und PCD nicht scharf ist, stellen sicher, dass alle den interzellulären Räumen im Bereich infiltriert die Erreger Aussetzung voll sind (siehe Punkt 2.4). Dies ist wichtig, wenn Sie Weitfeld-Fluoreszenz Stereomikroskope verwenden, da diese Mikroskope alle erkennbaren Signale entlang der gleichen vertikalen Position der Probe zu erfassen. Chlorophyll Autofluoreszenz von Überlebenden Zellen oberhalb oder unterhalb der Zellen im Bereich PKD Masken einfach die abgestorbenen Zellen ohne Autofluoreszenz ausstellen. Dies gilt auch für YFP Signal.
Bedingungen für Zeitraffer-Aufnahmen müssen sorgfältig durch mehrere Vorversuchen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen geschaffen werden. Parameter für Zeitraffer-Aufnahmen hängen von mehreren Faktoren wie mikroskopische System, transgene Pflanzen und pathogenen. Um diese Parameter zu erhalten, haben wir zunächst verschiedenen Belichtungszeiten für YFP Signalintensität im infiltrierten Blatt 7 HPI, die fast mit der Erstaktivierung pPR1zusammenfällt analysiert. Eine 5 s Belichtung wurde als geeignet für die Aufnahme von YFP Signal mit dem Stereomikroskop in dieser Studie verwendeten bestimmt. Ein ähnlicher Test wurde durchgeführt, für Chlorophyll Autofluoreszenz-Bildgebung. Belichtung der Probe zwischen 3 min Abständen wurde in Zeitraffer Bildbearbeitungsprogramm als normalen Hellfeld Bildgebung mit maximale Belichtungszeit programmiert. Unser System (Table of Materials) konnten wir 2,5 min neben YFP, TXR und Hellfeld Bildgebung haben. Diese Einschränkung war der Hauptgrund für die Wahl einer 3-Minuten-Intervalls. Als nächstes haben wir bestätigt, dass dieses Zeitraffer Bedingung keine offensichtlichen an der Pflanzenproben Schäden und nicht dazu, ektopische leichten stressbedingten Aktivierung des pPR1 (Abbildung 3B, C veranlassen). Dies führte zu der Entwicklung des Programms in dieser Studie verwendet. So 3 min Abständen der Fluoreszenz-Bildgebung wurden als ausreichend für die Erfassung von pPR1 Dynamik bei Pst_a2-ETI9vermittelt.
Veranstalter-Reporter Konstrukte wurden genutzt, vor allem mit dem fluoreszierenden Reporter verschmolzen, die NLS von vielen Gruppen und sind leicht zugänglich von der Forschungsgemeinschaft; Wir nutzten das Konstrukt von Kubo Et Al. veröffentlicht 13. das hier beschriebene Protokoll kann so in jeder Pflanze Biologie Studie untersucht Blatt Gewebe verwendet werden, wenn entsprechende transgene Pflanzen zur Verfügung stehen. Unsere einfach und leicht Protokoll sieht vor, dass eine große Chance für Forscher, die gerne die raumzeitliche Dynamik eines biologischen Ereignisses im analysieren lässt, z. B. Immunantwort. Es ist plausibel, dass unsere Methode mit Hilfe von Klebeband Stücken eine leichte körperliche Belastung an den Proben induziert. Dieses Problem kann auch entsprechende positive und negative Kontrollen, wie mock Behandlungen in den Experimenten (Abb. 3C) gesteuert werden. Die experimentellen Bedingungen können weiter modifiziert und optimiert, indem diese Steuerelemente unter verschiedenen Bedingungen zu analysieren.
In den letzten Jahren hat die rasante Entwicklung der bildgebenden Instrumente und Techniken das Interesse der Forscher in die komplexe räumlich-zeitliche Aspekte der biologischen Ereignisse angeregt. Bei der bildgebenden Analyse sind geeignete Montage und Befestigung der Proben zu den wichtigsten Themen. Die einfache und vielseitige Methode der Montage Leben verlässt Arabidopsis entwickelt in dieser Studie kann angewendet und optimiert für verschiedene bildgebende Experimente.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Japan Science and Technology Agency [PRESTO117665, S.B., ERATOJPMJER1502, N.N.] und von der Japan Society for Promotion of Science (Grants-in-Aid für die Forschung Tätigkeit Inbetriebnahme [22880008, S.B.] und für junge Wissenschaftler (B)] 23780040, S.B.]). Wir danken A. Senzaki, Y. Suzuki, Y. Sugisawa und E. Betsuyaku für hervorragende technische Unterstützung, J. Parker für die Bereitstellung der Pst_a2 Sorte und T. Demura für die Bereitstellung des pBGYN-Vektors.
Materials
| Bacto Agar | BD biosciences | 214010 | |
| Bacto Protease Peptone No. 3 | BD biosciences | 211693 | |
| Bacto Yeast Extract | BD biosciences | 212750 | |
| BM2 soil | Berger | ||
| Glycerol | nacalai tesque | 17017-35 | |
| Kanamycin sulfate | Wako | 113-00343 | |
| Leica M205FA with DFC365FX, LED_MCI and Leica EL6000 (Las X software-regulated) | Leica Microsystems | Yellow fluorescent protein (YFP) and Texas Red (TXR) filters installed | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Wako | 135-00165 | |
| Micro Slide Glass (Size: 76 mm × 26 mm, Thickness: 1.0–1.2 mm) | MATSUNAMI | S1112 | |
| Micropore Surgical Tape (1.25 cm × 9 m) | 3M | 1530-0 | |
| Needleless 1 ml plastic syringe | Terumo | SS-01T | |
| Plastic cell plug tray (cell size: 44 mm × 44mm × 44 mm) | Tanaka sangyo, Japan | htray-bk72 | Any tray with similar sized cells can be used |
| Rifampicin | nacalai tesque | 30259-81 | |
| Plastic Tape (0.2 mm thick × 19 mm wide × 10 m long) | Yamato | No0200-19-1 | Any plastic/vinyl tape with similar thickness can be used |
Riferimenti
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