Siderophore Hochdurchsatz-Screening von Umweltproben: Pflanzen, Gewebe, lose Böden und Rhizosphäre Böden
Summary
Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für die schnelle Screening von Umweltproben für Siderophore Potenzial zur Mikronährstoff-Bioverfügbarkeit und Umsatz in den terrestrischen Systemen.
Abstract
Siderophores (niedermolekulare Gewicht Metall chelatisierenden Verbindungen) sind in verschiedenen ökologischen Phänomen von Eisen (Fe) in Böden, für den Erreger Wettbewerb, Pflanze Wachstumsförderung und Kreuz-Königreich Signalisierung biogeochemische Radfahren wichtig. Darüber hinaus sind Siderophores auch kommerzielles Interesse an Feldversuchen und Bioweathering von Metall-Lager Mineralien und Erze. Eine schnelle, kostengünstige und robuste Mittel Siderophore Produktion in komplexen Proben quantitativ zu bewerten ist der Schlüssel zur Identifizierung von wichtigen Aspekte der ökologischen Auswirkungen von Siderophore Aktivitäten, einschließlich, neuartige Siderophore Mikroben produziert. Die hier vorgestellte Methode wurde entwickelt, um Siderophore Aktivität in Takt Microbiome Gemeinschaften in Umweltproben wie Boden- oder Gewebe zu beurteilen. Die Proben wurden homogenisiert verdünnt in einem modifizierten M9 Medium (ohne Fe) und Anreicherungskulturen waren für 3 Tage inkubiert. Siderophore Produktion wurde in Proben in 24, 48 und 72 Stunden (h) mit einem neuartigen 96-Well Mikrotestplatte CAS (Chrom Azurol Sulphonate) bewertet-Fe-Agar-Assay, eine Anpassung der die traditionell mühsam und zeitaufwändig farbmetrischen Methode zur Beurteilung der Siderophore Aktivitäten in einzelnen kultivierten mikrobielle Isolate. Unsere Methode, um 4 verschiedene Genotypen/Linien von Weizen (Triticum Aestivum L.), einschließlich Lewjain, Madsen, und PI561725 und PI561727, die häufig in der Binnenschifffahrt Pacific Northwest angebaut haben wir angewendet. Siderophore Produktion wurde das Erbgut des Weizens und in bestimmten Arten von Pflanzengewebe beobachtet deutlich beeinflusst. Wir verwendet erfolgreich unsere Methode schnell auf den Bildschirm für die Beeinflussung der Pflanze Genotyp Siderophore Produktion, eine Schlüsselfunktion in terrestrischen und aquatischen Ökosystemen. Wir produziert viele technische Wiederholungen, sehr zuverlässigen statistischen Unterschiede in Böden und im Pflanzengewebe nachgeben. Wichtig ist, zeigen die Ergebnisse, dass die vorgeschlagene Methode lässt sich schnell Siderophore Produktion in komplexen Proben mit einem hohen Maß an Zuverlässigkeit, in einer Art und Weise zu untersuchen, die Gemeinden für die spätere Arbeit Taxa und funktionelle Gene identifizieren bewahrt werden können.
Introduction
Siderophores sind wichtige Biomoleküle in erster Linie im Eisen-Chelat für Bioverfügbarkeit, aber mit einer Vielzahl von zusätzlichen Zwecke in terrestrischen und aquatischen Ökosystemen von mikrobiellen Quorum sensing, Signalisierung, mikrobielle Pflanze-Hosts, Pflanzen Sie, Wachstumsförderung, Kooperation und Wettbewerb innerhalb komplexer mikrobieller Gemeinschaften1,2. Siderophores können grob unterteilt werden entsprechend ihrer aktiven Zentren und Strukturmerkmale, Erstellen von vier Grundtypen: Carboxylat, Hydroxamate, Catecholate, und gemischte Typen3,4. Viele Mikroorganismen sind in der Lage, die Ausscheidung über mehrere Typen von Siderophore5 und in komplexen Gemeinschaften, eine große Mehrheit der Organismen Biosynthese Membranrezeptoren um die Aufnahme eine noch breitere Palette von Siderophores1zu ermöglichen, 6. Aktuelle Arbeit zeigt, dass Siderophores besonders wichtig auf Gemeinschaftsebene und sogar in Inter Königreich Kommunikations- und biogeochemischen Transfer7,8,9,10 ,11.
Chrom Azurol Sulphonate (CAS) hat seit über 30 Jahren als ein Chelatbildner verwendet worden, um Eisen (Fe) zu binden dergestalt, dass Zusatz von Liganden (z. B. Siderophores) Dissoziation des CAS-Fe-komplexes, erstellen eine leicht erkennbare Farbe Veränderung in das Medium führen kann 12. wenn die CAS mit Fe gebunden ist, der Farbstoff erscheint als eine Farbe Königsblau und wie der CAS-Fe-Komplex dissoziiert, das Medium verfärbt sich nach der Art der Liganden verwendet, um die Fe-13aufräumen. Das anfängliche, Liquid-basierter Medium von Schwyn und Neilands gegründet 1987, modifiziert, in vielerlei Hinsicht zu beherbergen, wechselnde mikrobielle Ziele14, Wachstum Gewohnheiten und Einschränkungen15sowie einer Vielzahl von Metallen neben Fe, einschließlich Aluminium, Mangan, Kobalt, Nickel Cadmium, Lithium, Zink16, Kupfer17und sogar Arsen18.
Viele menschliche Krankheitserreger, sowie als Wachstum fördert Mikroorganismen (PGPM) Pflanzen wurden identifiziert als Siderophore produzierenden Organismen3,19,20, und wichtige Rhizosphäre und endophytische PGPM oft testen positiv für die Siderophore-Produktion4. Die traditionelle Fe-basierte Flüssigkeit Methode wurde angepasst Mikrotiter-Isolate in der Bearbeitung für Siderophore Produktion21testen. Aber nicht diese Techniken, die Bedeutung der mikrobiellen Gemeinschaft als Ganzes (das Mikrobiom), in Zusammenarbeit und mögliche Regulierung der Siderophore Produktion in Böden und Pflanzen Systeme22zu erkennen. Aus diesem Grund haben wir eine Hochdurchsatz-Gemeinschaftsebene Bewertung der Siderophore Produktion von einer bestimmten Umgebung, basierend auf der traditionellen CAS-Assay, aber mit Replikation, Benutzerfreundlichkeit, Zuverlässigkeit und Wiederholbarkeit in einer Mikrotestplatte entwickelt. Assay.
In dieser Studie wird ein kostengünstiger, Hochdurchsatz-CAS-Fe-Assay zur Erkennung von Siderophore Produktion präsentiert, um die Bereicherung der Siderophore Produktion von komplexen Proben (z.B. Boden und Pflanze Gewebe Homogenates) zu bewerten. Bulk, locker gebunden und fest gebundene Rhizosphäre Boden (in Bezug auf wie der Boden um den Stamm gebunden war) wurden zusammen mit Korn, schießen und Wurzel Gewebe aus vier unterschiedlichen Weizen (Triticum Aestivum L.) Genotypen erhalten: Lewjain, Madsen, PI561725, und PI561727. Es wurde vermutet, dass grundlegende Unterschiede in der Weizen-Genotypen zu Unterschieden bei der Rekrutierung und Auswahl von Siderophore produzieren Gemeinschaften führen könnte. Von besonderem Interesse ist der Unterschied zwischen mikrobieller Gemeinschaften verbunden mit der PI561725 isogene Linie Aluminium tolerant, ist da sie ALMT1 (Aluminium-aktivierte Malat Transporter 1) besitzt, mit dem Aluminium im Vergleich empfindliche PI561727 isogenen Linie, die eine nicht-Aluminium ansprechende Form des Gens, almt123,24,25,26besitzt. Das Hauptziel der Studie war es, eine einfache und schnelle Methode quantitativ bewerten Siderophore Produktion in Siderophore Anreicherungskulturen von komplexen Probentypen unter Beibehaltung der Kulturen für die künftige Arbeit zu entwickeln.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das primäre Ergebnis dieser Arbeit ist die Herstellung einer neuen Methodik, die schnell zu bereichern für Siderophore produzieren Mikroben während der Messung quantitativ Siderophore/Produktionstätigkeit in der Umwelt Probe verwendet werden können. Die Methode ist schnell, einfach und kostengünstig, und die Ergebnisse zeigen, wie sie verwendet werden, um Siderophore Aktivität von komplexen und neuartige Probentypen erkennen (z. B.., Boden und Pflanze Gewebe). Das Protokoll führt auch bei der Herstellung…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Kalyani Muhunthan danken für Unterstützung in Laborverfahren, Lee Opdahl für Weizen Ernte Genotyp, die Washington State Concord Grape Research Council und der Washington State University Center für die Erhaltung der Landwirtschaft und Natürlichen Ressourcen für eine BIOAg gewähren, um diese Arbeit zu unterstützen. Zusätzliche Mittel lieferte die USDA/NIFA durch Schraffur-Projekt 1014527.
Materials
| Agarose | Apex | LF451320014 | |
| Aluminum Baking Pan | |||
| Aluminum Foil | |||
| Ammonium chloride, granular | Fiesher Scientific | 152315A | |
| Autoclave and Sterilizer | Thermo Scientific | ||
| Calcium chloride dihydrate | Fiesher Scientific | 171428 | |
| CAS (Chrome Azurol S) | Chem-Impex Int'l Inc) | 000331-27168 | |
| Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder | Fiesher Scientific | 1521754 | |
| EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal | J.T.Baker | JI2476 | |
| Glycerol, Anhydrous | Baker Analyzed | C22634 | |
| HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide | Reagent World | FZ0941 | |
| Hydrochloride acid | ACROS Organic | B0756767 | |
| Infinite M200 PRO plate reader | TECAN | ||
| Iron (III) chloride hexahydrate, 99% | ACROS Organic | A0342179 | |
| Laboratory Fume Hood | Thermo Scientific | ||
| Laboratory Incubator | VWR Scientific | ||
| Magnesium Sulfate | Fiesher Scientific | 27855 | |
| Niric Acid, (69-70)% | J.T.Baker | 72287 | |
| PIPES buffer, 98.5% | ACROS Organic | A0338723 | |
| Potassium phosphate, dibaisc,powder | J.T.Baker | J48594 | |
| Pyoverdine | SIGMA-ALDRICH | 078M4094V | |
| Sand | |||
| SI-600R Shaker | Lab Companion | ||
| Sodium chloride, granular | Fiesher Scientific | 136539 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J.T.Baker | G48K53 | |
| Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99% | ACROS Organic | A0371705 |
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