Sideróforo elevado-throughput Screening de amostras ambientais: tecidos, Bulk solos e solos de rizosfera de plantas
Summary
Apresentamos um protocolo para a seleção rápida de amostras ambientais para Sideróforo potencial, contribuindo para a biodisponibilidade de micronutrientes e volume de negócios em sistemas terrestres.
Abstract
Sideróforos (metal de peso molecular baixo quelantes compostos) são importantes em vários fenômeno ecológico variando de ferro (Fe) biogeoquímicos Ciclismo nos solos, a concorrência do patógeno, promoção de crescimento de planta e Cruz-Reino de sinalização. Além disso, sideróforos são também de interesse comercial em bioleaching e bioweathering de metais, minerais e minérios. Um meio rápido, custo-eficaz e robusto de avaliar quantitativamente a produção Sideróforo em amostras complexas é a chave para identificar aspectos importantes das ramificações ecológicas de atividade Sideróforo, incluindo, romance Sideróforo produzindo micróbios. O método aqui apresentado foi desenvolvido para avaliar a atividade Sideróforo no tato microbiome comunidades, em amostras ambientais, tais como tecidos de solo ou planta. As amostras foram homogeneizadas e diluídas em meio M9 modificado (sem fé), e culturas de enriquecimento foram incubadas por 3 dias. Produção de Sideróforo foi avaliada em amostras em 24, 48 e 72 horas (h) usando uma romance microplacas de 96 poços CAS (cromo azurol sulfonato)-ensaio de ágar de Fe, uma adaptação do método colorimétrico tradicionalmente tedioso e demorado de avaliação Sideróforo atividade, realizada em individuais isolados microbianos cultivados. Aplicamos o nosso método de 4 diferentes genótipos/linhas de trigo (Triticum aestivum L.), incluindo Lewjain, Madsen e PI561725 e PI561727 comumente cultivada no interior do noroeste do Pacífico. Produção Sideróforo claramente foi impactada pelo genótipo de trigo e em tipos específicos de tecidos vegetais observados. Temos utilizado com sucesso nosso método para a tela rapidamente para a influência do genótipo da planta na produção de Sideróforo, uma função fundamental nos ecossistemas terrestres e aquáticos. Nós produzimos muitas repetições de técnicas, gerando diferenças estatísticas muito confiáveis em solos e em tecidos vegetais. Importante, os resultados mostram que o método proposto pode ser usado para examinar rapidamente a produção Sideróforo em amostras complexas com um alto grau de confiabilidade, de uma forma que permite que as comunidades a ser preservado para posterior trabalho de identificar genes funcionais e táxons.
Introduction
Sideróforos são biomoléculas importantes envolvidos principalmente na quelação de ferro para a biodisponibilidade, mas com uma grande variedade de efeitos adicionais nos ecossistemas terrestres e aquáticos, variando de quórum microbiana sensoriamento, sinalizando a planta microbianas-hosts, promoção de crescimento de planta, cooperação e competição dentro de comunidades microbianas complexas1,2. Sideróforos podem ser classificados de acordo com seus sites ativos e características estruturais, criando quatro tipos básicos: carboxilato, hydroxamate, catecholate e misturado tipos3,4. Muitos microorganismos são capazes de excretar mais de um tipo de Sideróforo5 e nas comunidades do complexas, uma grande maioria dos organismos biossintetize os receptores de membrana para permitir a absorção de uma variedade ainda maior de sideróforos1, 6. Trabalho recente indica que sideróforos são particularmente importantes a nível comunitário e mesmo no Reino inter comunicação e transferências biogeoquímicos7,8,9,10 ,11.
Cromo azurol sulfonato (CAS) tem sido utilizado por mais de 30 anos como um agente quelante para ligar o ferro (Fe) de tal forma que a adição de ligantes (i.e., sideróforos) pode resultar em dissociação do complexo Fe-CAS, criando uma mudança de cor facilmente identificáveis no meio 12. quando o CAS está vinculado com o Fe, o corante aparece como uma cor azul royal, e como o complexo de CAS-Fe dissocia-se, o médio muda de cor de acordo com o tipo de ligante usado para eliminar a Fe13. O inicial, baseada em líquido médio estabelecido por Romualdo Silva e Neilands em 1987, foi modificado de várias maneiras para acomodar a alteração microbiana alvos14, hábitos de crescimento e limitações15, bem como uma variedade de metais além do Fe, incluindo alumínio, manganês, cobalto, níquel cádmio, lítio, zinco16, cobre17e nem arsênico18.
Muitos patógenos humanos, também como planta microorganismos promotores de crescimento (PGPM) foram identificados como organismos produtores de Sideróforo3,19,20e importante rizosfera e endofíticos PGPM frequentemente testar positivo para Sideróforo-produção4. O tradicional método de líquido baseado em Fe foi adaptado para microtitulação testes de isolados no cultivo para produção de Sideróforo21. No entanto, essas técnicas não reconhecem a importância da comunidade microbiana como um todo (o microbiome), em cooperação e Regulamento potencial de produção de Sideróforo no solo e planta sistemas22. Por esse motivo, nós desenvolvemos uma avaliação de nível comunitário alto rendimento de produção Sideróforo de um determinado ambiente, com base no ensaio CAS tradicional, mas com replicação, facilidade de medição, confiabilidade e repetibilidade em uma microplaca do ensaio.
Neste estudo, um ensaio CAS-Fe custo-benefício, alta produtividade para a detecção de produção Sideróforo é apresentado para avaliar o enriquecimento da produção Sideróforo de amostras complexas (ou seja, solo e planta homogenates de tecido). Solo da rizosfera granel, frouxamente ligados e firmemente ligados (em termos de como o solo era vinculado à raiz) foram obtidos juntamente com o grão, atirar e tecidos de raiz de quatro genótipos distintos trigo (Triticum aestivum L.): Lewjain, Madsen, PI561725, e PI561727. Foi hipotetisado que diferenças fundamentais em genótipos de trigo podem resultar em diferenças no recrutamento e selecção de Sideróforo produzindo comunidades. De particular interesse é a diferença entre as comunidades microbianas associadas com a linha isogénicas de PI561725, que é de alumínio tolerante porque possui ALMT1 (alumínio-ativado 1 transportador malato), comparada com o alumínio sensível PI561727 isogénicas linha, que possui uma forma de alumínio não responsiva do gene, almt123,24,25,26. O principal objetivo do estudo foi desenvolver um método simples, rápido de avaliar quantitativamente a produção Sideróforo em culturas de enriquecimento Sideróforo de tipos de amostras complexas, preservando as culturas para trabalhos futuros.
Protocol
Representative Results
Discussion
O resultado principal deste trabalho é a produção de uma nova metodologia que pode ser usada para enriquecer rapidamente para Sideróforo produzindo micróbios ao medir quantitativamente Sideróforo/actividade de produção da amostra ambiental. A metodologia é rápida, simples e econômica, e os resultados mostram como ele pode ser usado para detectar atividade Sideróforo de tipos de amostras complexas e romance (ex.., solo e planta de tecido). O protocolo também resulta na produção de estoques de glice…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores desejam agradecer a Kalyani Muhunthan para assistência em procedimentos laboratoriais, Lee Opdahl para a colheita do trigo genótipo, Conselho de pesquisa de Washington estado Uva Concord e centro de Universidade do estado de Washington para sustentar a agricultura e Recursos naturais para um BIOAg conceder para apoiar este trabalho. Adicionais de financiamento foi fornecido pelo USDA/NIFA através de projeto da Hatch 1014527.
Materials
| Agarose | Apex | LF451320014 | |
| Aluminum Baking Pan | |||
| Aluminum Foil | |||
| Ammonium chloride, granular | Fiesher Scientific | 152315A | |
| Autoclave and Sterilizer | Thermo Scientific | ||
| Calcium chloride dihydrate | Fiesher Scientific | 171428 | |
| CAS (Chrome Azurol S) | Chem-Impex Int'l Inc) | 000331-27168 | |
| Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder | Fiesher Scientific | 1521754 | |
| EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal | J.T.Baker | JI2476 | |
| Glycerol, Anhydrous | Baker Analyzed | C22634 | |
| HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide | Reagent World | FZ0941 | |
| Hydrochloride acid | ACROS Organic | B0756767 | |
| Infinite M200 PRO plate reader | TECAN | ||
| Iron (III) chloride hexahydrate, 99% | ACROS Organic | A0342179 | |
| Laboratory Fume Hood | Thermo Scientific | ||
| Laboratory Incubator | VWR Scientific | ||
| Magnesium Sulfate | Fiesher Scientific | 27855 | |
| Niric Acid, (69-70)% | J.T.Baker | 72287 | |
| PIPES buffer, 98.5% | ACROS Organic | A0338723 | |
| Potassium phosphate, dibaisc,powder | J.T.Baker | J48594 | |
| Pyoverdine | SIGMA-ALDRICH | 078M4094V | |
| Sand | |||
| SI-600R Shaker | Lab Companion | ||
| Sodium chloride, granular | Fiesher Scientific | 136539 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J.T.Baker | G48K53 | |
| Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99% | ACROS Organic | A0371705 |
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