Synthèse et bioconjugaison de Thiol-réactifs pour la création de Site-sélectivement modifiés immunoconjugués

Radiopharmaceutiques chimistes ont longtemps exploité la sélectivité et la spécificité des anticorps pour les biomarqueurs de la maladie pour les deux imagerie nucléaire et ciblé de radiothérapie¹. Approche et de loin la plus courante pour le radiomarquage d’anticorps se fonde sur l’attachement aveugle de radiomarquées groupes prosthétiques ou radiometal chélateurs aux acides aminés — le plus souvent les lysines — au sein de la structure de l’immunoglobuline ( Figure 1 a)². Si cette stratégie est certainement efficace, son caractère aléatoire et non spécifique au site peut créer des problèmes. Plus précisément, des approches traditionnelles bioconjugaison produisent mal défini et immunoconjugués hétérogène composé de mélanges de milliers de régioisomères différents, chacun avec son propre ensemble de propriétés biologiques et pharmacologiques³. En outre, bioconjugaison aléatoire peut entraver l’immunoréactivité d’anticorps si la cargaison est annexée aux domaines d’antigène-liant de l’immunoglobuline.

Au cours des années, une variété de stratégies spécifiques au site et site sélectif bioconjugaison ont été développés afin de répondre à ces problèmes^4,5. Le plus commun de ces approches s’appuie sur la ligature des sondes maléimide portant aux groupes sulfhydryles des cystéines (Figure 1 b). Les anticorps IgG1 contiennent naturellement des 4 ponts disulfure de chaîne inter, liens qui peuvent être réduites de manière sélective pour produire des thiols libres capables de subir des réactions d’addition de Michael avec maléimides forment des liaisons thioéther succinimidyl. L’utilisation des thiols et maléimides est certainement une amélioration par rapport aux méthodes traditionnelles et une grande variété de synthons maléimide-roulement et bifonctionnels chélateurs sont actuellement disponibles. Cependant, il est important de noter que cette méthode a des limites sérieuses aussi bien. Axée sur le Maléimide immunoconjugués présentent une stabilité limitée in vivo car le lien thioéther peut subir une réaction de rétro-Michael (Figure 2)^{6,7,8,9, 10}. cela, bien sûr, peut conduire à la libération de la charge radioactive ou son échange avec des biomolécules thiol porteur en circulation (p. ex., glutathion ou albumine sérique). Ces deux processus peuvent augmenter les concentrations d’activité dans les organes sains ainsi que diminuer les concentrations d’activité dans les tissus cibles, ce qui réduit d’imagerie de contraste et rapports thérapeutiques plus faibles. Plusieurs réactifs thiol réactif alternatives ont été développées dans le but de contourner ces problèmes, y compris les tosylates, bromo – et iodo-acétyles et vinyle sulfones^{11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17}. Cependant, toutes ces approches ont des limites qui ont nui à leur application généralisée.

Environ cinq ans, le laboratoire du feu Carlos Barbas III au Scripps Research Institute pionnier dans l’utilisation des sulfones méthyl phenyloxadiazolyl comme réactifs pour la formation sélective des liens extrêmement stables avec les thiols (Figure 1 et Figure 3) ^{18 , 19}. les auteurs salariés une variante de sulfone-roulement de méthyle phenyloxadiazolyl de fluorescéine pour modifier plusieurs anticorps conçus pour contenir des résidus de cystéine libre, produisant finalement immunoconjugués ont une stabilité supérieure qu’analogue constructions créées à l’aide de sondes maléimide. En voyant ces travaux prometteur, nous étions un peu surpris que cette technologie n’avait été utilisée guère en radiochimie et qu’il n’avait pas encore été utilisée du tout dans la synthèse des chélateurs bifonctionnels ou radioimmunoconjugates^20,21 . Ce manque d’applications, cependant, ne tarda pas à être plus judicieux : plusieurs tentatives de se procurer le réactif de Sigma-Aldrich a donné lieu à la réception des mélanges complexes de produits de dégradation avec < 15 % du composé désiré. En outre, synthétisant le réactif déclaré nous-mêmes n’était pas une option réaliste non plus, comme la voie de synthèse publiée est un peu encombrante et nécessite du matériel sophistiqué de chimie organique qui la plupart radiochimie et imagerie moléculaire laboratoires, y compris la nôtre — ne possèdent tout simplement pas.

En réponse à ces obstacles, nous présentons à créer facilement accessible et très stable phenyloxadiazolyl methyl sulfone réactif qui peut être obtenu via une voie de synthèse robuste et assez facile. Plus tôt cette année, nous avons signalé la création d’un modulaire, stable et réactif de phenyloxadiazolyl facilement accessible methyl sulfone — surnommé « PODS » — comme une plate-forme pour bioconjugations axée sur les thiols (Figure 1 et Figure 3)²². La différence essentielle entre les GOUSSES et le réactif rapporté par Barbas, Al est que le premier emploie un anneau aniline attaché à la portion de sulfone de méthyle phenyloxadiazolyl, alors que ce dernier dispose d’un phénol dans la même position (Figure 4). Ce changement facilite une voie de synthèse plus simple et plus accessible que — si notre expérience avec le composé disponible dans le commerce est emblématique — un réactif final plus stable. Dans ce travail, nous aussi synthétisé une paire de GOUSSES renfermant des chélateurs bifonctionnels — dosettes-MPO et GOUSSES-CHX-A”-DTPA — pour faciliter la création de ⁸⁹Zr – et ¹⁷⁷marqué Lu radioimmunoconjugates, respectivement. Comme nous allons le voir, nous avons démontré que bioconjugations site-sélective axée sur les GOUSSES de façon reproductible et robuste créer radioimmunoconjugates homogène, bien définis, hautement immunoréactive et très stable. En outre, les expériences précliniques dans des modèles murins de cancer colorectal ont montré que ces site sélectivement marqués radioimmunoconjugates pièce performance in vivo supérieure par rapport aux anticorps radiomarqués synthétisés par axée sur le maléimide conjugaisons.

L’objectif primordial de ce travail est de faciliter la création des immunoconjugués bien définis, homogène, très stable et hautement immunoréactives pour applications in vitro et in vivo. L’approche synthétique est assez simple à effectuer dans n’importe quel laboratoire, et le réactif de GOUSSES parent peut être modifié avec une pléthore de différents chélateurs, fluorophores ou des cargaisons. Dans ce protocole et la vidéo qui l’accompagne, nous allons décrire la synthèse simple, quatre étapes des GOUSSES (Figure 5) ; la création d’une variante de GOUSSES porteuses de DOTA, un chélateur largement utilisé pour la coordination des ⁶⁴Cu, ⁶⁸Ga, ¹¹¹, ¹⁷⁷Lu et ²²⁵Ac (Figure 6) ; et la bioconjugaison de GOUSSES-DOTA d’un anticorps de modèle, le trastuzumab IgG1 ciblant HER2 (Figure 7).