Met behulp van In Vitro fluorescentie Resonance Energy Transfer te bestuderen van de dynamiek van eiwitcomplexen op de tijdschaal van een milliseconde

Biologische activiteit worden uiteindelijk uitgevoerd door eiwitten, meest waarvan communiceren met anderen voor goede biologische functies. Met behulp van een rekenkundige benadering, de totale hoeveelheid eiwit-eiwitinteractie in mens wordt geschat op ~ 650.000¹en verstoring van deze interacties vaak leidt tot ziekten². Als gevolg van hun essentiële rol bij het beheersen van cellulaire en organisch processen, zijn tal van methoden ontwikkeld om te bestuderen van eiwit-eiwitinteractie, zoals gist-twee-hybride, bimolecular fluorescentie complementatie, split-luciferase complementatie en co-immunoprecipitation assay³. Terwijl deze methoden goed zijn in het ontdekken en bevestiging van eiwit-eiwitinteractie, ze zijn meestal niet-kwantitatieve en dus beperkte informatie verstrekken over de verwantschap tussen de interactie eiwit-partners. Kwantitatieve pull-downs kunnen worden gebruikt voor het meten van de bindende affiniteit (bijvoorbeeld de dissociatieconstante K_d), maar het niet meet de kinetiek van de binding, noch kan het worden toegepast wanneer de K_d erg laag als gevolg van een ontoereikende is Signal-to-noise verhouding⁴. Oppervlakte plasmon (SPR) resonantie spectroscopie kwantificeert de kinetiek van bindende, maar het vereist een specifieke oppervlakte en immobilisatie van een reactieve op het oppervlak, die de bindende eigenschap van het reactieve⁵kan wijzigen. Bovendien is het moeilijk voor SPR voor het meten van de snelle associatie en dissociatie tarieven⁵, en het is niet gepast gebruik van SPR te karakteriseren van de gebeurtenis van het uitwisselen van eiwit subeenheden in een eiwit complex. Hier beschrijven we een methode waarmee het meten van de tarieven van eiwit complex montage en demontage op de tijdschaal van een milliseconde. Deze methode was essentieel voor het bepalen van de rol van Cullin –eenssociated –Nedd8 –oissociated eiwit 1 (Cand1) als de F-doos eiwit uitwisseling factor^6,7.

Cand1 regelt de dynamiek van Skp1•Cul1•F-box eiwit (SCF) E3 ligases, die tot de grote familie van Cullin-RING ubiquitin ligases behoren. SCF bestaan uit de cullin Cul1, die de RING domein proteïne Rbx1 bindt, en een verwisselbare F-doos-eiwit, dat werft substraten en bindt Cul1 via de adapter proteïne Skp1⁸. Als een ligase E3, SCF katalyseert de vervoeging van ubiquitin aan de ondergrond, en het wordt geactiveerd wanneer het substraat is aangeworven door de F-doos-eiwit, en als Cul1 door de ubiquitin-achtige eiwitten Nedd8⁹wordt gewijzigd. Cand1 bindt ongewijzigde Cul1, en op bindende, het verstoort zowel de vereniging van Skp1•F-box eiwit met Cul1 en de vervoeging van Nedd8 naar Cul1^10,11,12,13. Dientengevolge, Cand1 leek, moet een inhibitor van de omwenteling van het SCF-activiteit in vitro, maar Cand1 deficiëntie in organismen veroorzaakt gebreken dat suggereert een positieve rol van Cand1 bij het reguleren van de SCF activiteiten in vivo^{14,15,16 , 17}. deze paradox werd eindelijk verklaard door een kwantitatieve studie waaruit bleek de dynamische interacties tussen Cul1, Cand1 en Skp1•F-box eiwit. Met behulp van fluorescentie resonantie energie transfer (FRET) testen die de vorming van de Cul1•Cand1 en Financieringsmiddelen complexen detecteren, de associatie en dissociatie stem constanten (k_op en k_uit, respectievelijk) werden individueel gemeten. De metingen bleek dat zowel Cand1 als Skp1•F-box eiwit vorm uiterst krap complex met Cul1, maar de k_af van SCF dramatisch door de Cand1 toegenomen is en de k_af van Cul1•Cand1 is sterk toegenomen door Skp1•F-vak eiwit^6,7. Deze resultaten verlenen de initiële en kritische steun voor het definiëren van de rol van Cand1 als een eiwit uitwisseling factor, die de vorming van nieuwe SCF complexen via recycling van Cul1 uit de oude SCF complexen katalyseert.

Hier presenteren we de procedure voor de ontwikkeling en het gebruik van de FRET bepaling te bestuderen van de dynamiek van de Cul1•Cand1 complexe⁷, en hetzelfde principe kan worden toegepast om te bestuderen van de dynamiek van verschillende biomoleculen. FRET treedt op wanneer een donor enthousiast met de juiste golflengte is, en een accepteerder met excitatie spectrum overlapt het emissiespectrum van de donor aanwezig binnen een afstand van 10-100 is Å. De geëxciteerde toestand wordt overgebracht naar de acceptor, waardoor verminderen de intensiteit van de donor en de acceptor intensiteit¹⁸verhogen. De efficiëntie van de FRET (E) is afhankelijk van zowel de Förster straal (R₀) en de afstand tussen de donor en acceptor fluorophores (r), en wordt bepaald door: E = R₀⁶/ (R₀ ⁶ + r⁶). De Förster straal (R₀) hangt af van enkele factoren, waaronder de dipool hoekige oriëntatie, de spectrale overlap tussen het donor-acceptor paar, en de oplossing gebruikt¹⁹. Toe te passen van de bepaling van de FRET op een fluorimeter gestopt-stroom, die de verandering van de emissie van de donor in real-time monitoren en metingen van snelle k_op en k_uitkunt, is het noodzakelijk om efficiënte FRET die resulteert in een aanzienlijke vermindering van de uitstoot van de donor. Daarom ontwerpen van efficiënte FRET door het kiezen van het juiste paar fluorescente kleurstoffen en sites op de doel-eiwitten te hechten de kleurstoffen is belangrijk en zal worden besproken in dit protocol.