זיהוי של סובסטרטים קינאז CK2 הרומן תוך שימוש בגישה הביוכימי רב-תכליתי
Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא תווית להעשיר, לזהות סובסטרטים של קינאז CK2 מתוך מדגם ביולוגיים מורכבים כגון תא lysate או homogenate הרקמה. שיטה זו ממנפת את ההיבטים הייחודיים של הביולוגיה CK2 למטרה זו.
Abstract
המחקר של קינאז-המצע יחסים חיונית כדי להשיג הבנה מלאה של הפונקציות של אנזימים אלה ומטרות במורד הזרם שלהם במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים. CK2 הוא קינאז סרין אבולוציונית שנשמרת/תראונין עם הרשימה המתארכת של מאות סובסטרטים מעורבים תהליכים תאיים מרובים. בשל תכונותיו pleiotropic, זיהוי ואפיון ערכה מקיפה של סובסטרטים CK2 כבר מאתגר במיוחד, נשאר משוכה במחקר של אנזים חשוב זה. כדי לטפל באתגר זה, אנו פיתחו אסטרטגיה ניסיוני רב תכליתי המאפשר את העשרה יישוב וזיהוי של בשם דיאלקטריים CK2. פרוטוקול זה מנצל יחודיות ייחודי מצע משותף כפול של CK2 ומאפשר thiophosphorylation ספציפיים של סובסטרטים שלו בתא או רקמות lysate. חלבונים אלו המצע לאחר מכן alkylated, immunoprecipitated, ו המזוהה באמצעות ספקטרומטר מסה טנדם/כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS/MS). השתמשנו בעבר גישה זו בהצלחה לזהות CK2 סובסטרטים מן השחלות דרוזופילה ולהרחיב כאן אנחנו היישום של פרוטוקול זה לתאים אנושיים גליובלסטומה, הממחישות את יכולת ההתאמה של שיטה זו לחקור התפקיד הביולוגי של קינאז דגם אורגניזמים שונים, מערכות ניסויות.
Introduction
חלבונים kinases הם רכיבי מפתח של האות התמרה חושית cascades. זרחון של חלבונים המצע על ידי אנזימים אלה מעורר תגובות ביולוגיות להסדיר אירועים קריטיים שליטה חלוקת התא, חילוף החומרים, בידול, בין היתר. CK2 הוא קינאז ביטוי ubiquitously, acidophilic סרין/טראונין זה חוק של שמרים לבני אדם, זה ממלא תפקידים חשובים רבים תהליכים תאיים ועד תקנה תעתיק מחזור התא התקדמות אפופטוזיס1 ,2,3. האנזים הוא heterotetramer המורכב שני α קטליטי (או α’) subunits וβ רגולטוריות שני subunits4. בנוסף להיותו מאוד pleiotropic, CK2 מוצגים שני יוצא דופן מאפיינים אחרים זה לסבך את הניתוח שלה, כלומר פעילות מכוננת5 ו- ירידה לפרטים מצע משותף כפול6. המאפיין האחרון הזה מעניק CK2 עם היכולת להשתמש GTP, כמו גם ATP עבור זרחון של חלבונים המצע.
מחיקת גנטי subunits קטליטי או תקניות של CK2 בעכברים גורמת lethality עובריים המציין כי זה משחק תפקיד מכריע במהלך פיתוח ו-7,organogenesis8. CK2 הוא overexpressed גם כמה סוגים של סרטן ומייצגת ובכך מבטיח מטרה טיפולית9,10,11. אכן, ספציפית מעכבי פעילות קינאז CK2 את היעד הם כעת תחת חקירה זו מטרה12,13,14. בעוד עיכוב של CK2 היא אפשרות מעשית, בהתחשב באופי pleiotropic שלה, חלופה אולי גישה יותר הגיוני יהיה היעד קריטית סובסטרטים CK2 העומדים בבסיס את התקדמות סרטן מסוימים. לכן, מקיף זיהוי ואפיון של חלבונים המצע CK2 יהיה של יתרון משמעותי עבור שחקרתי את function(s) ספציפיים של קינאז בתוך סוג הרקמה או גידול מסוים.
כאן, אנו מתארים שיטה ביוכימית רב-תכליתי לזיהוי CK2 סובסטרטים מתוך מדגם ביולוגיים מורכבים כגון תאים או רקמות lysate. פרוטוקול זה מנצל יחודיות כפול מצע משותף של CK2 על-ידי שימוש אנלוגי GTP GTPγS (5′-[γ-thio]triphosphate) guanosine שלא kinases אנדוגני אחרים יכולים להשתמש. דבר זה מאפשר ביעילות את קינאז “לסמן” שלה מצעים בתוך את הדוגמית הזו. עבור הבאים בידוד וזיהוי.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מתארים שיטה הביוכימי פשוט יחסית לזיהוי סובסטרטים של קינאז CK2 מתוך מדגם ביולוגיות מורכבות. השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה מבוססים על מאפייני אנזימטי יוצא דופן CK2 וכוללים CK2 תלוית thiophosphorylation של חלבונים ספציפיים המצע באמצעות GTPוγS ו immunoprecipitation הבאים וזיהוי שלהם. עם התוצאות האלה, ה…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק שיפור המחקר אוניברסלי קהיליה מחלקת פנסילבניה הבריאות T.I.S.
Materials
| 12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
| 2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
| Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
| cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
| Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
| Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
| Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
| Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
| T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
| Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |
Riferimenti
- Litchfield, D. W. Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death. Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).
- Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2). Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).
- Meggio, F., Pinna, L. A. One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2. The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).
- Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme. The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).
- Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme. Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).
- Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2. Nature Structural & Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).
- Lou, D. Y., et al. The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development. Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).
- Buchou, T., et al. Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality. Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).
- Chua, M. M., et al. CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target. Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).
- Tawfic, S., et al. Protein kinase CK2 signal in neoplasia. Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).
- Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).
- Siddiqui-Jain, A., et al. CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy. Ricerca sul cancro. 70 (24), 10288-10298 (2010).
- Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies. Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).
- Perea, S. E., et al. CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).
- Xiao, S., et al. Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation. PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).
- Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).
- Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity. Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).
- McMillan, E. A., et al. The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis. Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).
- Turowec, J. P., et al. Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells. Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).
- Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).
- Bian, Y., et al. Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow. Scientific Reports. 3, 3460 (2013).
- Franchin, C., et al. Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).
- Franchin, C., et al. Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).
