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Immunologia e infezioni

Produktion von Pseudotyped Partikel hoch pathogene Coronaviren in eine Einstellung "Biosafety Level 2" zu studieren

Published: March 01, 2019
doi:
10.3791/59010
, , , , , ,
1Department of Microbiology and Immunology, College of Veterinary Medicine,Cornell University, 2INRA, Virologie et Immunologie Moléculaires, 3Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering,Cornell University, 4Department of Microbiology, College of Agricultural and Life Sciences,Cornell University, 5Horae Gene Therapy Center,University of Massachusetts Medical School

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur pseudotyped Partikel in eine Einstellung “BSL-2” unter Einbeziehung der Spike-Protein des hoch pathogenen Viren Nahen Osten respiratorisches Syndrom und Schweres Akutes Respiratorisches Syndrom Coronaviren zu generieren. Diese pseudotyped Partikel enthalten eine Luciferase Reporter-gen ermöglicht die Quantifizierung der Virus Eintritt in Zielzellen Host.

Abstract

Das Protokoll soll Coronavirus (CoV) Spike (S) Schmelzverfahren Protein erzeugen pseudotyped Partikel mit einem murine Leukämie-Virus (MLV) Kern und Luciferase Reporter, mit einem einfachen Transfektion Verfahren der weithin verfügbar HEK-293T Zelllinie. Nachdem gebildet und von Produzent Zellen befreit, integrieren diese Pseudovirions eine Luciferase Reporter-gen. Da sie nur enthalten die heterologe Coronavirus spike Protein auf ihrer Oberfläche, die Teilchen verhalten sich wie ihre native Coronavirus-Pendants für Eintrag Schritte. Als solche sind sie ausgezeichnete Surrogate der native Virionen für virale Eintrag in Wirtszellen zu studieren. Nach erfolgreicher Eingabe und Infektion in Zielzellen die Luciferase Reporter bekommt in das Wirtsgenom Zelle integriert und drückt. Mit einem einfachen Luciferase Assay, können ausgestrahlt Zellen leicht quantifiziert werden. Ein wichtiger Vorteil des Verfahrens ist, dass es in biologische Sicherheit durchgeführt werden, Stufe 2 (BSL-2) Einrichtungen anstelle von BSL-3 Einrichtungen für die Arbeit mit hoch pathogenen Coronaviren wie Nahost respiratorisches Syndrom Coronavirus (MERS-CoV) erforderlich und Schweres Akutes Respiratorisches Syndrom Coronavirus (SARS-CoV). Ein weiterer Vorteil stammt aus seiner Vielseitigkeit, wie es auf Umschlag Proteine gehören für alle drei Klassen von viralen Fusionsproteine, wie Klasse ich Grippe Hämagglutinin (HA) und Ebola-Virus Glykoprotein (GP), Klasse II Semliki Forest Virus E1 angewendet werden können Protein, oder die Klasse III vesikuläre Stomatitis Virus G Glykoprotein. Eine Einschränkung der Methodik ist, dass es nur Virus Eintrag Schritte vermittelt durch das Hüllprotein untersucht rekapitulieren kann. Für das Studium anderen viralen Lebenszyklus Schritte, sind andere Methoden erforderlich. Untersuchung von Host Cell Anfälligkeit und Tropismus und Prüfung der Auswirkungen des Virus Entry Inhibitoren virale Eintrag Wege verwendet sezieren Beispiele für viele Anwendungen, die, denen diese Pseudotypes Partikel in verwendet werden können.

Introduction

Host Zelleneintrag stellt die ersten Schritte des viralen Infektionskrankheiten Lebenszyklus. Für behüllte Viren handelt es sich um Bindung an einen einzelnen Host-Zelle-Rezeptor oder mehrere Rezeptoren, gefolgt von Fusion von viralen und zellulären Membranen. Diese wesentlichen Funktionen erfolgt durch Virushülle Glykoproteine1,2. Das Coronavirus Umschlag Glykoprotein heißt das Spike (S)-Protein und ist ein Mitglied der Klasse ich virale Fusion Proteine2,3,4,5,6. Glykoproteine der Virushülle zu studieren ist für viele wichtige Eigenschaften eines bestimmten Virus, wie das Verständnis von entscheidender Bedeutung: Lifecycle Einleitung, seine Gastgeber und zelluläre Tropismus, Interspezies Übertragung, virale Pathogenese, sowie Host-Zell-Eintrag Wege. Pseudotyped Viruspartikel, auch benannt Pseudovirions, sind mächtige Werkzeuge, die es ermöglichen, die Funktion des viralen Fusionsproteine leicht zu untersuchen. Pseudotyped Partikel oder Pseudovirions sind chimärer Virionen, die aus einem Surrogat virale Kern mit einer heterologen virales Hüllprotein an ihrer Oberfläche bestehen. Das Protokoll soll zeigen, wie Sie erhalten Coronavirus spike pseudotyped Teilchen, basieren auf einem murine Leukämie-Virus (MLV) Kern und eine Luciferase Reporter-gen enthalten. Als Beispiele die Methode pseudotyped Teilchen mit der Spike-Proteine des hoch pathogenen schwere akute Atemwegssyndrom (SARS) und Nahen Osten respiratorisches Syndrom (MERS) Coronaviren produzieren vorgestellt. Das Protokoll beschreibt die Transfektion Verfahren beteiligt, wie anfällig Ziel zu infizieren Zellen, und Infektiosität Quantifizierung von Luciferase Assay.

Da der Eintrag Schritte von der Pseudovirions der Coronavirus S an ihrer Oberfläche unterliegen, treten sie Zellen in ähnlicher Weise zu einheimischen Kollegen. Als solche sind sie ausgezeichnete Surrogate von funktionalen Infektiosität Assays. Pseudotyped Partikel stammen in der Regel aus der elterlichen Modell Viren wie Retroviren (MLV7,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 und dem Lentivirus Human Immunodeficiencyvirus, HIV-23,24,25,26,27,28,29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35) oder Rhabdoviruses (vesikuläre Stomatitis Virus – VSV36,39,40,41,42,43,44 , 45 , 46 , 47). in Pseudotyping verwendet, die elterliche Viren Genome werden geändert, um die wesentlichen Gene, wodurch sie für die Durchführung eines vollständigen Replikationszyklus defekt zu entfernen. Diese Funktion ermöglicht es ihnen, in zwischen-Biosafety Level Einrichtungen (BSL-2) verwendet werden und ist ein wichtiger Vorteil gegenüber der Verwendung von hoch pathogener native Viren, die erfordern höhere biologische Anlagen (BSL-3, BSL-4, die nicht so leicht zugänglich sind) wenn Virus-Eintrag Dirigierstudium. Hier die S-Proteine des Risikos Gruppe 3 Krankheitserreger SARS-CoV und MERS-CoV dienen als Beispiele der Virushülle Proteine in MLV pseudotyped Partikel, Generierung von SARS-CoV S und MERS-CoV S Pseudovirions (SARS-Spp und MERS-Spp, beziehungsweise). Diese Pseudovirions wurden in Studien mit Schwerpunkt auf Eintrag Veranstaltungen von diesen Viren48,49,50,51erfolgreich eingesetzt. Ein weiterer Vorteil ist, dass die hier beschriebene Technik nicht auf Pseudotyping Coronavirus S Proteine beschränkt: Es ist sehr flexibel und kann verwendet werden, um die Vertreter aller drei Klassen von viralen Fusionsproteine zu integrieren. Beispiele hierfür sind Influenza Hämagglutinin (HA, Klasse I)52, Ebola-Virus Glykoprotein (GP Klasse I), E1-Protein der Alphavirus Semliki Forest Virus (SFV, Klasse II) und der VSV Glykoprotein (G, Klasse III)53. Darüber hinaus kann mehr als eine Art von virale Glykoprotein Co integriert in ein pseudotyped Teilchen, wie im Fall von Grippe werden HA und NA – pseudotyped Partikel51.

Basierend auf den Arbeiten von Bartosch Et Al.20, dieses Protokoll beschreibt die Generation der MLV pseudotyped Partikel mit einer drei-Plasmid-Co-Transfektion Strategie mit der weithin verfügbar und hochkompetenten Transfektion HEK 293T Zelllinie 54. das erste Plasmid kodiert die MLV Kern Gene gag und Pol aber fehlt das MLV-Umschlag- Env -gen. Das zweite Plasmid ist ein Transfer-Vektor, die kodiert ein Glühwürmchen Luciferase Reporter-gen, ein MLV Ψ-RNA Verpackung Signal zusammen mit 5′- und 3′-flankierenden MLV lange terminal Repeat (LTR) Regionen. Das dritte Plasmid kodiert dem Schmelzverfahren Protein des Interesses, in diesem Fall entweder das SARS-CoV S oder MERS-CoV S-Protein. Auf Co-Transfektion von drei Plasmide mit einem Transfection Reagens bekommen virale RNA und Proteine in den transfizierten Zellen ermöglicht pseudotyped Teilchenerzeugung ausgedrückt. Da MLV Pseudovirion Rückgrat verwendet wird, dies geschieht bei der Plasmamembran: der RNAs, enthält das Luciferase-gen Reporter und Verpackung Signal bekommen gekapselt in entstehenden Partikel, die auch Plasmamembran ausgedrückt Coronavirus Spike integrieren Proteine. Die Partikel, die aus den Zellen heraus Knospe enthalten das Coronavirus S-Protein auf ihrer Oberfläche und sind für den Einsatz in Infektiosität Assays geerntet. Weil pseudotyped Partikel das Coronavirus S-Protein und nicht die MLV Hüllprotein Hafen bei Zellen zu infizieren, Verhalten sie sich wie ihre native Coronavirus-Pendants für Eintrag Schritte. Die virale RNA, enthält der Luciferase Reporters und flankierende LTRs wird dann innerhalb der Zelle freigegeben und die retrovirale Polymerase-Aktivitäten ermöglichen, ihren reversen Transkription in DNA und Integration in das Wirtsgenom Zelle. Quantifizierung der Infektiosität der Viruspartikel pseudotyped in infizierten Zellen erfolgt dann mit einem einfachen Luciferase Aktivität Assay. Da die DNA-Sequenz, die in das Wirtsgenom Zelle integriert wird nur das Luciferase-gen und keiner der MLV oder Coronavirus Protein-Kodierung Gene enthält, sind sie von Natur aus sicherer als Replikation zuständigen native Viren verwenden.

Abgesehen davon, dass sicherer Surrogate und sehr anpassungsfähig, Einbau von verschiedenen Arten von Umschlag Glucoproteide ermöglichen, pseudotyped Partikel, die hier beschrieben sind auch sehr vielseitig und können verwendet werden, um viele Aspekte des Virus Eintrag zu studieren. Dies beinhaltet aber nicht beschränkt auf: Testen Host Zelle Anfälligkeit für Virus-Infektion, Analyse der zellulären Eintrag Wege eine behüllten Viren verwendet, die Auswirkungen der pharmakologischen Inhibitoren und Drogen-Screenings, Durchführung von Neutralisation Antikörper Assays, Charakterisierung Host Zelleneintrag von behüllten Viren, die kultiviert werden kann nicht, und generieren von viralen Vektoren für die gen-Lieferung, stabile zelluläre Expression von Genen des Interesses oder Gen-silencing.

Protocol

(1) Zelle für Pseudotyped Partikelherstellung Aussaat Hinweis: Führen Sie diesen Schritt in der Biosicherheit Kabinett. Durch Standardzelle Kulturtechniken, erhalten eine 80-90 % konfluierende 75 cm2 Fläschchen der HEK-293T/17-Zellen passagiert in komplette Dulbecco ist modifiziert Eagle Medium (DMEM-C), enthält 10 % (Vol/Vol) fetalen bovine Serum (FBS), 10 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1- Piperazineethanesulfonic Säure (HEPES), 100 IU/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin. Bereiten Sie DMEM-T Medium für Transfektionen (seine Zusammensetzung ist das gleiche wie DMEM-C, aber ohne Antibiotika). Waschen Sie Zellen mit 10 mL der vorgewärmten (37 ° C) Dulbecco Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) zweimal.Hinweis: HEK293T/17-Zellen mit Sorgfalt zu behandeln, da sie leicht lösen. Den Überstand abgesaugt und lösen Zellen mit 1 mL 0,25 % Trypsin-Lösung bei 37 ° c vorgewärmt Legen Sie den Kolben der Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2 Inkubator 3−5 min oder bis die Zellen beginnen sich trennen.Hinweis: Vermeiden Sie Zellen mit Trypsin für mehr als 5 min Inkubation, da dies in der Regel zu Zelle Klumpenbildung führt. Trypsin durch Zugabe von 4 mL DMEM-C Medium und Anzahl Zellen unter Verwendung einer Zelle zählen Folie und Lichtmikroskop zu deaktivieren.Hinweis: Um zu vermeiden, zu viele Zellen zu zählen, kann eine zusätzliche Verdünnungsschritt vorher erforderlich sein. Denken Sie daran, in dieser Verdünnung Faktor bei der Berechnung der tatsächlichen Zelldichte von trypsiniert Zellen. Verdünnen Sie Zellen, 5 x 105 Zellen/mL mit DMEM-C. Samen 6-Well-Zellkultur-Platte mit 2 mL der Zelle Lösung pro Bohrloch und sanft hin und her bewegen der Plattenrandes und Seite an Seite Zellen, Vermeidung von kreisenden Bewegungen gleichmäßig zu verteilen.Hinweis: Dies ist ein wichtiger Schritt. Gleichmäßig verteilte Zellen werden sichergestellt, dass die Zellen in der Mitte der Brunnen nicht verklumpen zu tun. Im Gegenzug damit gute Transfektion Wirkungsgrade und pseudotyped Partikel Produktion. Inkubieren Sie die Platte über Nacht (16 – 18 h) in einem 37 ° C, 5 % CO2 Zelle Kultur Inkubator. 2. drei-Plasmid Co-Transfektion Hinweis: Führen Sie diesen Schritt in der Biosicherheit Kabinett. Beobachten Sie Zellen unter einen invertierten Lichtmikroskop für die Zellmorphologie und Dichte zu überprüfen.Hinweis: Im Idealfall sollte die Zelldichte im Bereich von 40 – 60 % confluency. Es ist wichtig, dass Zellen sind weder zu Zusammenfluss (80−90 % Zusammenfluss) noch zu dünn verteilt (20−30 % Zusammenfluss) in jede Vertiefung. Eine Zelldichte von 40−60 % Konfluenz wird gute pseudotyped Partikel Produktion zu gewährleisten. Plasmide mischen Berechnen Sie den Plasmid-Mix für jeden Umschlag Glykoprotein folgende Mengen für einen Brunnen von einem 6-Well-Platte, die in Tabelle 1dargestellt. Multiplizieren Sie Mengen zu, wenn mehrere Brunnen transfecting und beinhalten Sie einen zusätzliche Brunnen zu verhindern, dass der Mix.Hinweis: Zusammen mit dem SARS-CoV S und MERS-CoV S Kodierung Plasmide enthalten leere Vektor-Kontrolle für die Generation der Negativkontrolle Teilchen die Virushülle Glykoproteine (Δenv Partikel) zusammen mit einer Positivkontrolle Glykoprotein wie fehlt vesikuläre Stomatitis-Virus (VSV) G Glykoprotein, das bekannt ist, eine sehr breite Palette von Zellen (VSV-Gpp) robust zu infizieren. Plasmide sind auf Anfrage erhältlich. Mischen Sie berechneten Mengen von Plasmiden und reduzierte Serum Zellkulturmedium (siehe Tabelle der Materialien) in einem Microcentrifuge Schlauch. Lipid-basierte Transfection Reagens mischen (siehe Tabelle der Materialien) Berechnen Sie die Volumen für den Transfection Reagens Mix aus für einen Brunnen (1:3 Transfektion Verhältnis, multiplizieren Mengen je nach Bedarf) in Tabelle 2 angegebenen Mengen. Enthalten Sie zusätzliche Bohrungen zu verhindern, dass der Transfection Reagens Mischung. Mischen Sie berechneten Mengen an Lipid-basierte Transfection Reagens (3 µL pro Well) und reduzierte Serum Zellkulturmedium (47 µL pro Well) in einem Microcentrifuge Schlauch, und achten Sie auf die Transfektion Reagenz in der reduzierten Serum Zellkulturmedium und nicht die andere Weise hinzufügen rund um. Beide Mischungen inkubieren (für einen Brunnen: 50 µL Plasmide mischen und 50 µL der Lipid-basierte Transfection Reagens mischen) separat für 5 min bei Raumtemperatur. Fügen Sie den Inhalt des Transfection Reagens Mix der Plasmide Mischung im Verhältnis 1:1 (für 1 gut: 50 µL jeder Mix) Führen Sie gründlich auf-ab pipettieren der resultierenden Mischung. Inkubieren Sie die Mischung für mindestens 20 Minuten bei Raumtemperatur. Aspirieren der abgebrannten Mediums der Zellen. Fügen Sie sanft 1 mL vorgewärmten (37 ° C) reduzierte Serum Zellkulturmedium pro Bohrloch. Addieren Sie tropfenweise 100 µL Transfektion Mix in jede Vertiefung.Hinweis: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie Brunnen der HEK-293T die Transfektion Mischung hinzufügen, wie sie leicht lösen. Inkubieren Sie Zellen in einem 37 ° C, 5 % CO2 Zelle Kultur Inkubator für 4 – 6 h. Fügen Sie 1 mL pro gut vorgewärmte (37 ° C) DMEM-T Medium, die keine Antibiotika enthaltenHinweis: Dies ist ein wichtiger Schritt. Transfektion Reagenzien erhöhen Zelle Permeabilität und Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika. Um gute Transfektion Effizienz und pseudotyped Partikelherstellung zu gewährleisten, ist es wichtig zu vermeiden, mit Antibiotika-haltigem Zellkulturmedium Inkubieren Sie Zellen in einem 37 ° C, 5 % CO2 Zelle Kultur Inkubator für 48 h. 3. pseudotyped Partikel Sammlung Hinweis: Führen Sie diesen Schritt in der Biosicherheit Kabinett. Beobachten Sie die Zellen unter umgekehrten Lichtmikroskop für Zellmorphologie und Allgemeinzustand zu überprüfen. Überprüfen Sie auch die Farbe des Mediums Licht sein sollte leicht rosa/orange.Hinweis: Dies ist ein wichtiger Schritt. Wenn es zuviel Zelltod die Transfektion zugeordnet oder die mittlere Farbe Orange/gelb (saurer pH-Wert) aktiviert, wird dies in der Regel niedrigere Erträge in infektiöse Partikel pseudotyped zugeordnet werden Übertragen Sie Überstände von transfizierten Zellen auf 50 mL konisch Zentrifuge Rohre. Zentrifugieren Sie Rohre bei 290 X g 7 min, Zelle Ablagerungen zu entfernen. Filtern Sie geklärte Überstände durch einen sterilen 0,45 µm Pore Größe Filter. Kleines Volumen Aliquote zu machen (z. B.., 500 µL oder 1 mL) pseudotyped Viren-Lösung in Cryovials. Shop bei-80 ° C.Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Pseudotyped Partikel sind für viele Monate stabil bei-80 ° C, aber einmal aufgetaut, vermeiden, da sie Infektiosität verliert erneut eingefroren 4. pseudotyped Partikel Infektion anfällig für Zellen Hinweis: Führen Sie diesen Schritt in der Biosicherheit Kabinett. Zelle Aussaat von empfänglichen Zellen in 24-Well-Platte Durch Standardzelle Kultur Techniken 80−90 % konfluierende 75 cm2 Fläschchen der empfänglichen Zellen erhalten: Vero-E6 Zellen für SARS-CoV pseudotyped Partikel (SARS-Spp) und Huh-7 Zellen für MERS-CoV S pseudotyped Partikel (MERS-Spp).Hinweis: Um zu bestätigen, ob die pseudotyped Partikel, die produziert wurden ansteckend sind, ist es wichtig, eine geeignete anfällig Zelllinie für Pseudovirion Infektiosität Assays sorgfältig auswählen. Mit schlecht permissive Zellen führt zu niedrige Infektiosität. Waschen Sie Zellen zweimal mit 10 mL vorgewärmten (37 ° C) DPBS. Den Überstand abgesaugt und lösen Zellen mit 1 mL 0,25 % Trypsin-Lösung bei 37 ° c vorgewärmt Legen Sie den Kolben der Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2 Inkubator 3−5 min oder bis die Zellen beginnen sich trennen.Hinweis: Vermeiden Sie Zellen mit Trypsin länger als 5 Minuten Inkubation, da dies in der Regel zu Zelle Klumpenbildung führt. Huh-7 Zellen sind besonders empfindlich auf diesen Effekt. Trypsin durch Zugabe von DMEM-C Medium und Anzahl Zellen unter Verwendung einer Zelle zählen Folie und Lichtmikroskop zu deaktivieren. Verdünnen Sie Zellen, 5 x 105 Zellen/mL mit DMEM-C. Samen Brunnen von einer 24-Well-Platte mit 0,5 mL der Zelle Lösung pro Bohrloch und sanft hin und her bewegen die Platte und Seite an Seite Zellen, Vermeidung von kreisenden Bewegungen gleichmäßig zu verteilenHinweis: Dies ist ein wichtiger Schritt. Gleichmäßig verteilte Zellen werden sichergestellt, dass die Zellen in der Mitte der Brunnen nicht verklumpen zu tun. Dadurch wird wiederum gute Infektiosität Tests sichergestellt. Jede pseudotyped Partikel (SARS-Spp, MERS-Spp) Zustand Vorbereitung und drei Brunnen für drei experimentellen repliziert. Enthalten Sie Brunnen für die nicht-infizierten (N.I), leerer Vektor Δenv Partikel und Positivkontrolle Partikel wie VSV-Gpp Inkubieren Sie die Platte über Nacht (16−18 h) in einem 37 ° C, 5 % CO2 Zelle Kultur Inkubator Pseudotyped Partikel Infektion Beobachten Sie Zellen, die unter dem Lichtmikroskop und bestätigen Sie visuell, dass es ein konfluierende Teppich aus Zellen. Cryovials pseudotyped Viren auf Eis auftauen zu bringen. Wash-Zellen dreimal mit 0,5 mL (37 ° C) DPBS vorgewärmtHinweis: Dies ist ein wichtiger Schritt. Zellen, die vor der Infektion in der Regel führen zu schlechten Infektiosität anzeigen nicht richtig gespült werden Aspirieren Sie die Überstände der Zellen. Zellen mit 200 µL der aufgetauten pseudotyped Partikel Lösung zu impfen. Inkubieren Sie Zellen in einem 37 ° C, 5 % CO2 Zelle Kultur Inkubator für 1−2 h. 300 µL vorgewärmten (37 ° C) DMEM-C Medium hinzufügen. Inkubieren Sie Zellen in einem 37 ° C, 5 % CO2 Zelle Kultur Inkubator für 72 h. (5) Infektiosität Quantifizierung durch Luciferase Assay auslesen Hinweis: Erste Schritte in der Biosicherheit Kabinett. Tauwetter Luciferin Substrat (bei-80 ° C gelagert) und 5 X Luciferase Lyse Testpuffer (bei-20 ° C gelagert) bis sie Zimmertemperatur erreicht. Verdünnen Sie Lyse Testpuffer Luciferase, 1 X mit sterilem Wasser. Abzusaugen Sie Überstände von Zellen infiziert mit pseudotyped Partikel. Jedes gut 100 µL 1 X Luciferase Lyse Testpuffer hinzufügen. Die Platte auf einer Wippe und inkubieren Sie für 15 min mit rocken bei Raumtemperatur (ab diesem Zeitpunkt die Platte außerhalb eines Biosafety Kabinett behandelt werden kann). Jede Vertiefung bereiten Sie Mikrozentrifugenröhrchen durch Zugabe von 20 µL Substrat Luciferin in jedem Röhrchen vor. Schalten Sie die Luminometer. Durchführen Sie Luciferase Aktivitätsmessung einer gut zu einem Zeitpunkt durch die Übertragung von 10 µL lysate, ein Röhrchen mit 20 µL Substrat Luciferin. Streichen Sie das Rohr vorsichtig, um Inhalt zu mischen, aber vermeiden verdrängt die Flüssigkeit auf die Wände der Röhre. Ort der Röhre im Gerät und schließen Sie den Deckel. Messen Sie Lumineszenz-Wert des Rohres durch den Einsatz der Luminometer. Notieren Sie die relative leichte Maßeinheit. Wiederholen Sie die Schritte 5,8 – 5.12, bis alle Brunnen analysiert werden.Hinweis: Mit entsprechender Ausrüstung wie eine Platte lesen Luminometer kann dieser Vorgang automatisch ausgeführt. Der Test muss Plattenformat (z.B., 96-Well-Plattenformat) skaliert werden. (6) Datenanalyse Berechnung und Darstellung der relativen Luciferase Einheiten Mittelwerte und Standardabweichungen Verwenden Sie einen Graphen Plotten Software zur Berechnung von Luciferase Assay Messung Mittelwerte und Standardabweichungen der experimentellen und biologischen repliziert. Plot-Daten als Balkendiagramm mit Standardabweichungen.Hinweis: Wenn statistische Auswertungen von Daten durchführen, repliziert stellen Sie sicher, dass mindestens drei biologische in Datensätzen.

Representative Results

Repräsentative Ergebnisse der Infektiosität Assays von SARS-CoV S und MERS-CoV S pseudotyped Partikel sind in Abbildung 1dargestellt. Wie erwartet, für beide Abbildung 1A und 1 b, der VSV G pseudotyped positive Kontrolle Partikel (VSV-Gpp) gab sehr hohen durchschnittlichen Infektiosität in den 106 bis 107 relative Luciferase Einheiten (RLU) bzw. reichen. Für SARS-CoV S pseudotyped Partikel (Abb. 1A) Infektion anfällig Vero-E6-Zellen, eine starke durchschnittliche Infektiosität gemessen wurde auf rund 9,8 x 104 RLU. Dieser Wert ist fast 3 Größenordnungen höher als die Messwerte für das Steuerelement nicht infiziert (1.1 x 102 RLU), oder die Δenv Partikel (1,5 x 102 RLU), die keine Glykoproteine der Virushülle an ihrer Oberfläche Hafen. In ähnlicher Weise für MERS-CoV S pseudotyped Partikel (Abbildung 1B) die Infektion Huh-7 Zellen, eine hohe durchschnittliche Infektiosität gemessen wurde auf rund 1,0 x 106 RLU. Dies ist fast 4 Größenordnungen höher als die Messwerte für das Steuerelement nicht infiziert (0,8 x 102 RLU), oder die Δenv Partikel (2.0 x 102 RLU). Ein zusätzliche Infektiosität-Assay wurde durchgeführt, in denen die SARS-Spp und MERS-Spp wurden seriell verdünnt und Vero-E6 Zellen (Abb. 2A) infizieren. Dieser Test bestätigt, dass die Luciferase-Aktivität gemessen abhängig von der Konzentration der Partikel verwendet ist, um Zellen zu infizieren. Zur Bestätigung der Rolle des Angiotensin converting Enzyms 2 (ACE2) und Dipeptidyl Peptidase 4 (DPP4), die Rezeptoren des SARS-CoV und MERS-CoV, bzw. bei der Vermittlung von Anhaftung und Eintrag der pseudotyped Partikel verwendet wir schlecht permissive HEK-293T Zellen und Sie auszudrücken, entweder ACE2 oder DPP4 transfiziert (Abbildung 2B). Die transfizierten Zellen wurden dann für eine Infektiosität Assay verwendet. Diese Analyse zeigt, dass bei der Überexpression von ACE2 und DPP4, gibt es eine ~ 4-Log und ~ 2-Protokoll Zunahme für die Infektiosität SARS-Spp und MERS-Spp, bzw. bestätigen, dass Rezeptor die Nutzung des Pseudovirions ist ähnlich wie die native Viren. Die hier gezeigten Beispiele zeigen, wie wichtig einschließlich negative (nicht-infizierten, Δenv Partikel) sowie Positivkontrolle (VSV-Gpp) Bedingungen bei der Herstellung von pseudotyped Partikel. In der Tat erlauben die Positivkontrolle VSV-Gpp-Partikel uns zu beurteilen, ob eine bestimmte Charge pseudotyped Partikel nachgeben Funktions- und infektiöse Pseudovirions erfolgreich war. Ergebnisse der typische Infektion von VSV-Gpp-Partikel in die meisten Säugetier-Zelle, die Linien in der 106−107 RLU Bereich sind erwartet. Probleme mit der HEK-293T/17-Produzent Zellen (hohe Passagenanzahl, Probleme mit Zelldichten) oder schlechte Transfektion Wirkungsgrade können Auswirkungen auf insgesamt pseudotyped Partikelherstellung und Infektiosität. Darüber hinaus sind die Negativkontrolle Bedingungen ebenfalls wichtig, denn sie ermöglichen es uns, zu beurteilen, die Grundlinien der RLU-Messungen in einer bestimmten Zelle Zeile (nicht infizierten Zustand) und unspezifische Internalisierung der Partikel (Δenv Infektion), die nicht vermittelt wird durch ein virales Hüllprotein. Im Idealfall für eine bestimmte Art von Teilchen pseudotyped mit einer Virushülle Protein des Interesses empfiehlt es sich, Werte zu erhalten, die ein paar Größenordnungen höher als die negativ-Kontrolle-Werte sind, wie hier im Bild 1A, B. Jedoch, wenn für einen bestimmten Zelltyp eine pseudotyped Virus-Infektion sehr wenig Infektiosität gibt (d. h., schließen zu Negativkontrollen wie in Abbildung 2B in non-transfizierten N.T Bedingungen) es nicht notwendigerweise bedeutet, dass die pseudotyped Partikelherstellung war defekt. Es könnte gut sein, dass bestimmte Zelllinie verwendet ist nicht oder schlecht permissive Infektion. Es wird empfohlen, zu prüfen, ob ein bestimmten Zelltyp, anfällig für Infektionen sein, durch das Virus untersucht soll. Transfecting schlecht permissive Zellen mit Plasmid(s) zum Ausdruck zu bringen, die virale Receptor(s) effizienter virale Eintrag und Infektionen auftreten, wie in gezeigt Abbildung 2B, wo bei der Transfektion von ACE2 und DPP4-Rezeptoren im können Ziel HEK-293T Zellen, gibt es eine 4 ~- und ~ 2-Log Zunahme der Infektiosität, beziehungsweise. Plasmid/Reagenz Menge pCMV-MLVgagpol MLV Gag und Pol Plasmid-Codierung 300 ng pTG-Luc Übertragung Vektor mit Luciferase reporter 400 ng PcDNA-SARS-S, PcDNA-MERS-S oder leere Vektor 300 ng Reduzierte Serum Zellkulturmedium Zu 50 µL Tabelle 1: Mengen von Plasmiden und reduzierte Serum Zell-Kulturmedium erforderlich, um einen Brunnen von einem 6-Well-Platte von HEK-293T/17-Zellen für pseudotyped Partikelherstellung transfizieren. Berechnen Sie durch die Konzentration von Plasmid Vorbereitungen das benötigte Volumen um die erforderliche Menge von Plasmid DNA zu erreichen. Wenn mehr als ein Brunnen mit den gleichen Plasmiden transfiziert, multiplizieren Sie Volumen durch die erforderliche Anzahl von Brunnen zu transfizieren, und beinhalten Sie einen zusätzliche Brunnen in Berechnungen zu verhindern, dass der Mix in späteren Schritten. Der Gesamtbetrag der DNA werden transfiziert ist 1 µg/Brunnen. Plasmide sind auf Anfrage für Autoren. Reagenz Menge Transfection Reagens 3 ΜL Reduzierte Serum Zellkulturmedium 47 ΜL Tabelle 2: Mengen von Transfection Reagens und reduzierte Serum Zell-Kulturmedium erforderlich, um einen Brunnen von einem 6-Well-Platte von HEK-293T/17-Zellen für pseudotyped Partikelherstellung transfizieren. Multiplizieren Sie Volumen durch die erforderliche Anzahl von Brunnen zu transfizieren und zusätzliche Brunnen in Berechnungen zu verhindern, dass der Mix in späteren Schritten. Die Transfektion Reagenz: Plasmid DNA-Verhältnis beträgt 3:1. Abbildung 1 : Coronavirus S-pseudotyped Partikel Infektiosität Assays in empfänglichen Wirtszellen unter Verwendung einer murine Leukämie-Virus (MLV) Rückgrat und Luciferase Reporter-gen. (A) SARS-CoV S pseudotyped Partikel Infektiosität Assay in Vero-E6-Zellen. (B) MERS-CoV S pseudotyped Partikel Infektiosität Assay in Huh-7 Zellen. Für beide (A) und (B), gezeichneten Daten entspricht die durchschnittliche relative Luciferase-Einheiten von drei unabhängigen Experimenten mit Fehlerbalken, Standardabweichung (s.d.) entspricht. Daten in Log-10 -Skala auf der y-Achse aufgetragen. N.I: nicht-infizierten Kontrolle; Δenv: Infektion mit pseudotyped Partikel ohne Glykoproteine der Virushülle und VSV-Gpp: Infektion mit pseudotyped Partikel tragen Positivkontrolle VSV G Umschlag Glykoprotein. Andere Kürzel verwendet, SARS-Spp: Infektion mit SARS-CoV S pseudotyped Partikel, MERS-Spp: Infektion mit MERS-CoV S pseudotyped Partikel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2 : Konzentration-Abhängigkeit der CoV S-Pseudovirion Infektiosität und Rolle der ACE2 und DPP4-Rezeptoren in SARS-Spp und MERS-Spp Eintrag. (A) Konzentration-Abhängigkeit der SARS-Spp und MERS-Spp Infektiosität durch Luciferase Aktivität Assay gemessen. Pseudovirions wurden seriell verdünnt und Vero-E6 Zellen infizieren. (B) Infektiosität Assay von SARS-Spp und MERS-Spp in schlecht permissive HEK 293T Zielzellen, ausdrückliche ACE2 transfiziert und DPP4-Rezeptoren, beziehungsweise. Daten gezeichnet in Log10 Skala auf y-Achse wie in Abbildung 1 aus doppelten Experimente mit Fehlerbalken, Standardabweichung (s.d.) entspricht. N.T: nicht transfizierten HEK 293T Kontrollzellen; ACE2: Angiotensin converting Enzym 2 (SARS-CoV-Rezeptor) und DPP4: Dipeptidyl Peptidase 4 (MERS-CoV-Rezeptor). Andere Abkürzungen sind die gleichen wie in Abbildung 1. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um effizient zu produzieren, pseudotyped Partikel mit der S-Protein der Gefahr Gruppe 3 Coronaviren, SARS-CoV und MERS-CoV, inmitten der BSL-2. Diese Partikel, die eine Luciferase Reporter-gen zu integrieren, können wir leicht Coronavirus S-vermittelten Eintrag Ereignisse durch eine relativ einfache Luciferase Assay48,49,50,51quantifizieren. In Infektiosität Assays mit freizügigen Zellen bestätigen wir, dass die Luciferase-Aktivität gemessen abhängig von der Konzentration der Partikel ist. Darüber hinaus ermöglicht ACE2 und DPP4-Rezeptor-Transfektion effizienter Eintrag in schlecht permissive Zelllinien, wie HEK-293T Zellen. Die Methode ist sehr anpassungsfähig an andere Glykoproteine der Virushülle und wurde ausgiebig verwendet48,49,50,51,52,53, 55,56,57,58,59, oft zu anderen Tests wie biochemische Analysen oder native Virusinfektionen zu ergänzen.

Das Protokoll, die, das wir hier beschreiben, basiert auf den Retrovirus MLV, die Luciferase Reporter enthält. Es ist jedoch wichtig zu betonen, dass es eine sehr breite Palette von anderen Pseudotyping-Systemen, die erfolgreich für Verpackung Coronavirus S12,13,25,26, entwickelt wurden 30 , 31 , 32 und anderen Virushülle Glykoproteine10,11,14,16,17,23,24, 29 , 33 , 38 , 40 , 42 , 44 , 46. einige dieser anderen Systeme basieren auf den gängigen MLV retrovirale Kern7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20, oder basierend auf der weit verbreiteten Lentivirale HIV-1 Pseudotyping System mit verschiedenen Strategien23,24,25,26,27,28,29,30 ,31,32,33,34,35, oder mit dem Rhabdovirus vesikuläre Stomatitis Virus (VSV) als Kern, wodurch eine Vielzahl zu integrieren der Umschlag Glucoproteide und wieder mit verschiedenen beschäftigt Strategien37,38,39,40,41,42,43 ,44,45,46,47. Darüber hinaus andere Reporter wie fluoreszierende Proteine wie GFP11,13 und RFP36oder Enzyme als Luciferase wie β-Galaktosidase16,17 und abgesondert alkalische Phosphatase (SEAP)42 worden für Messungen erfolgreich eingesetzt. Darüber hinaus wurde in der Probe in diesem Protokoll vorgestellt, eine transiente Transfektion verwendet, um MLV und CoV S Gene und Proteine zum Ausdruck bringen. Allerdings gibt es andere Strategien zum Ausdruck, wie Erzeugung von stabilen Zelllinien für die Produktion von pseudotyped Viren7,14. Da jedes dieser Systeme haben ihre vor- und Nachteile, es ist wichtig, die folgenden wichtigen Parameter zu berücksichtigen, bei der Entscheidung, welche Pseudotyping System am besten ein Ermittler passt: Pseudovirion Kern (MLV, HIV-1, VSV oder andere), wie selektiv ist ein besondere Pseudotyping Kern bei der Einbeziehung einer bestimmten Virushülle Glykoprotein, Reporter für Assay auslesen (GFP, Luciferase, SEAP o.ä.) und die Transfektion Strategie (Anzahl der Plasmide Co Transfektion, transiente beteiligt Transfektion oder die Generierung von stabilen Zelllinien).

Es gibt eine Reihe von kritischen Schritte in der Methode, die hervorzuheben sind. Zelldichte, besonders von der HEK-293T/17-Produzent-Zell-Linie ist ein kritischer Faktor für erfolgreiche Transfektion. Eine Zelldichte im Bereich von 40 – 60 % Konfluenz erwies sich als optimal. Höhere dichten führen in der Regel niedrige Transfektion Effizienz und niedrigen Partikelherstellung. Darüber hinaus ist es wichtig, im Hinterkopf behalten, dass HEK-293T/17 Zellen weniger Anhänger als andere Zell-Linien. Im Umgang mit ihnen um zu vermeiden, trennen sie unnötig Vorsicht vorzugehen. Eine Option ist zur Behandlung von Zelle Kultur Kunststoffoberflächen mit Poly-D-Lysin, Einhaltung zu verbessern. Darüber hinaus führt höhere Zelle Passage häufig zu schlechter Transfektion Preise. Nach dem Hinzufügen des Transfection Reagens HEK-293T/17-Zellen, ist es auch wichtig zu bedenken, dass die Durchlässigkeit der Zelle erhöht. Deshalb an dieser Stelle ist es am besten zu vermeiden, mit mittlerer mit Antibiotika, da sie Zytotoxizität verstärken können. Überprüfen Sie vor der Erhebung pseudotyped Partikel die Farbe der transfizierten HEK-293T/17-Zelle-Überstände. Kulturmedium Zellenfarbe dauert in der Regel, nach 48 h Transfektion, eine Orange-rosa Farbton. Gelb-farbigen Medium in der Regel führt zu schlechten pseudotyped Partikel Erträge und ist oft eine Folge der Probleme mit der Aussaat Dichte oder hohe Passagenanzahl Zelle.

In diesem Protokoll wird in einem 6-Well-Plattenformat pseudotyped Partikelherstellung durchgeführt. Zum Erhöhen der Lautstärke des erzeugten Partikel, mehrere Brunnen von einem 6-Well-Platte können mit der gleichen Mischung Plasmide transfiziert und die Überstände können gebündelt werden. Der Pool kann dann geklärt, gefiltert und regelmÄÑig sein. Alternativ können maßstabsgetreu Produktion auf andere Arten von Schiffen (z.B. 25 oder 75 cm2 Fläschchen) verwendet. In diesem Fall sollten Transfektion Bedingungen entsprechend skaliert. In diesem Protokoll wird die Infektiosität Assay mit einer 24-Well-Platte-Format und einem Luminometer, der Messungen nur eine Röhre zu einem Zeitpunkt erlaubt durchgeführt. Für Hochdurchsatz-Screenings sind auch andere Formate möglich, z.B. 96-Well-Plattenformat und eine Platte Leser Luminometer. Volumen und Reagenzien für die Luciferase-Assays müssen entsprechend angepasst werden. Lagerung von pseudotyped Partikel in Cryovials bei-80 ° C erhält ihre Stabilität für mehrere Monate ohne spürbaren Rückgang der Infektiosität. Es empfiehlt sich nicht unterwerfen, um Frost-Tausalz Zyklen, da dies ihre Infektiosität im Laufe der Zeit sinkt. So ist es am besten, sie speichern in kleinen Aliquote z. B. 0,5 – 1 mL und tauen sie vor einer Infektion.

Die hier vorgestellte Methode hat mehrere Einschränkungen. Ein wichtiger ist die Tatsache, dass pseudotyped Partikel nur virale Eintrag Ereignisse rekapitulieren. Um weitere Schritte im Lebenszyklus Infektionskrankheiten zu analysieren, sind weitere Tests erforderlich. Darüber hinaus wie MLV Partikel Knospe an der Plasmamembran, es wichtig ist, denken daran, dass die Umschlag-Glykoprotein untersuchten braucht um auch Besucher auf der Plasmamembran für den Einbau in Pseudovirions während der Produktion. Als solches ist es wichtig zu wissen, wo in der Zelle ein bestimmtes Virushülle Glykoprotein in Transfektion Bedingungen, wie z. B. durch die Visualisierung subzelluläre Lokalisation mit einem Immunfluoreszenz-Assay und/oder indem auf Aufbewahrung Signale innerhalb ausgedrückt wird Das Protein. Auch, während das Protokoll beschreibt die Schritte zur Herstellung und Prüfung der Infektiosität, detailliert es nicht wie Einbeziehung der Virushülle Glykoproteine in pseudotyped Partikel gemessen. Eine Methode ist, western-Blot Assays auf konzentrierte Lösungen von Partikeln, wie zuvor beschrieben50,51 MERS-CoV S Aufnahme durchführen. In diesen Tests ist das S-Umschlag-Glykoprotein des MERS-CoV zusammen mit dem Kapsid (p30) Protein von MLV, sondiert die ermöglichen es uns, die Aufnahme des Proteins S in Partikel zu normalisieren. Weitere Beispiele für solche Tests analysieren Virushülle Glykoprotein Einbindung in Pseudovirions wurden für SARS-CoV S Einbindung in eine HIV-1 Lentivirale Pseudovirion System32 , Ebola-Glykoprotein (GP) in ein anderes MLV pseudotyped durchgeführt Partikel-System17, und Grippe Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) in VSV Pseudovirions38. Eine neuere Entwicklung bei der Charakterisierung pseudotyped Partikelherstellung ist der Einsatz von innovativen imaging-Geräte wie z. B. Nanosight: es ermöglicht uns, direkt zu visualisieren, zu quantifizieren und Größe Viruspartikel50. Das Gerät liefert detaillierte Informationen über allgemeine Partikelherstellung; Allerdings ist es wichtig, im Hinterkopf behalten, dass es keine Informationen auf Umschlag Glykoprotein Einbau anbietet. Zukünftige Ausrichtung für die Anwendung dieser vielseitig Pseudovirion-Teilchen besteht darin, einzelne virale Fusion Ereignisse mit Einzelkorn tracking, Mikrofluidik und Totalreflexion Fluoreszenz-Mikroskopie60,61 analysieren ,62. Solche Ansätze wurden erfolgreich auf Influenza-Virus und feline Coronavirus Partikel sowie Grippe HA – und NA-pseudotyped VSV-basierte Pseudovirions63angewendet. Der Einsatz solcher Techniken auf Coronavirus S-pseudotyped MLV-basierte Partikel angewendet wird derzeit entwickelt.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir wünschen allen Mitgliedern der Whittaker und Daniel Labs für die hilfreichen Kommentare danken. Forschungsförderung durch das NIH lieferte R21 AI111085 und R01 AI135270 gewährt. T.t. räumt Unterstützung seitens der Presidential Life Science Fellowship in Cornell University und National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program unter Grant Nr. DGE-1650441. L.n. räumt Unterstützung durch ein Samuel C. Fleming Familie Graduate Fellowship und National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program unter Grant Nr. DGE-1650441. Diese Arbeit wird auch durch die National Science Foundation 1504846 (, S.D. und G.R.W.) unterstützt.

Materials

Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells  ATCC CRL-11268 Clone 17 cells are highly competent for transfection.
African green monkey kidney epithelial Vero-E6 cells ATCC CRL-1586
Human hepatic Huh-7 cells  Japan National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition JCRB0403
Inverted light microscope with 10 × objective  Nikon TS100
Dulbecco’s modification of Eagle's medium (DMEM) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine without sodium pyruvate Corning Mediatech 10-017-CV
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Gibco 1614071
1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic acid (HEPES)  Corning Mediatech 25-060-Cl
100 × penicillin-streptomycin (PS) solution Corning Mediatech 30-002-Cl
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+  Corning Mediatech 21-030-CV
0.25% trypsin, 2.21 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1 × solution  Corning Mediatech 25-053-Cl
Cell counting slides with grids  Kova 87144
Opti-minimal essential medium (Opti-MEM) Thermo Fisher Scientific, Gibco 31985-070
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher Scientific, Invitrogen 11668-027
0.45 µm pore-size sterile filter  Pall 4184
10 mL syringes  BD 309604
5 × luciferase assay lysis buffer  Promega E1531
Luciferin, substrate for luciferase assay Promega E1501
Sterile water  VWR E476-1L
GloMax 20/20 luminometer  Promega 2030-100
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Millet, J. K., Tang, T., Nathan, L., Jaimes, J. A., Hsu, H., Daniel, S., Whittaker, G. R. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. J. Vis. Exp. (145), e59010, doi:10.3791/59010 (2019).
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