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Genetica

Gentechnische Veränderung von Dictyostelium Discoideum Zellen basierend auf Auswahl und das Wachstum von Bakterien

Published: January 25, 2019
doi:
10.3791/58981
, , , , , , ,
1MRC Laboratory of Molecular Biology, 2Department of Molecular and Cell Biology,University of Connecticut, 3Cancer Research UK Beatson Institute Glasgow, 4MRC Laboratory for Molecular Cell Biology,University College London, 5Department of Cell and Developmental Biology,University College London

Summary

Dictyostelium Discoideum ist ein beliebter Modellorganismus, komplexe zelluläre Prozesse wie Zelle Migration, Endozytose und Entwicklung zu studieren. Das Dienstprogramm des Organismus ist abhängig von der Machbarkeit der Genmanipulation. Hier präsentieren wir Ihnen Methoden, um Dictyostelium Discoideum Zellen zu transfizieren, die bestehende Grenzen der Kultivierung Zellen in flüssigen Medien zu überwinden.

Abstract

Dictyostelium Discoideum ist eine faszinierende Modellorganismus zur Erforschung der Zelle Differenzierungsprozesse während Entwicklung, Zelle und andere wichtige zelluläre Biologie Fragen. Die Technologien zur Verfügung, Dictyostelium Zellen genetisch zu manipulieren sind gut entwickelt. Transfektionen können mit verschiedenen wählbaren Markierungen und Marker, Recycling, einschließlich homologe Rekombination und insertional Mutagenese durchgeführt werden. Dies wird unterstützt durch eine gut kommentierte Genom. Jedoch diese Ansätze sind optimiert für axenic Zelllinien in flüssigen Kulturen wachsen und schwierig anzuwenden, nicht axenic Wildtyp Zellen, die nur sich von Bakterien ernähren. Die Mutationen, die in axenic Stämme sind, Ras-Signalisierung, verursacht übermäßige Macropinocytosis erforderlich für die Fütterung zu stören und beeinträchtigen Zellwanderung, die die Interpretation der Signaltransduktion und Chemotaxis Experimente in dieser Stämme verwirrt. Frühere Versuche, nicht axenic Zellen genetisch zu manipulieren haben Effizienz und erforderlichen komplexen experimentellen Verfahren fehlte. Wir haben ein einfaches Transfektion Protokoll entwickelt, die zum ersten Mal diese Grenzen überwindet. Diese Reihe von großen Verbesserungen an Dictyostelium molekulare Genetik erlauben Wildtyp Zellen so einfach wie standard Laborbelastungen manipuliert zu werden. Neben den Vorteilen für das Studium uncorrupted Signal- und Motilität Prozesse können Mutanten, die Macropinocytosis abgestütztes Wachstum stören jetzt leicht isoliert werden. Darüber hinaus ist die gesamte Transfektion Workflow erheblich beschleunigt, mit rekombinanten Zellen, die in Tagen statt Wochen generiert werden können. Ein weiterer Vorteil ist, dass molekulare Genetik mit frisch isolierte Wildtyp Dictyostelium Proben aus dem Umfeld weiter durchgeführt werden kann. Dies kann helfen, den Anwendungsbereich der Ansätze auf diesen Forschungsgebieten.

Introduction

Gattung Dictyostelium sind Boden-lebendige soziale Amöbe, die vor allem von Bakterien ernähren. In der Phylum Amoebozoa gestellt, eine große Anzahl von Arten wurden isoliert, können in vier verschiedenen Stämme1gruppiert werden. Gattung Dictyostelium Discoideum (D. Discoideum) geworden beliebter Modellorganismus, komplexe zelluläre Prozesse wie Zelle Migration und Phagozytose zu studieren. Zu kontrollieren und zu standardisieren Versuchsbedingungen, axenic Zelle Linien entwickelt worden, die in komplexen oder definierten flüssigen Medium in der Abwesenheit von Bakterien2wachsen können. Von besonderer Bedeutung sind die Ax2, Ax3, und Ax4 Stämme, die alle in den 1970er Jahren erzeugt und schließlich von einem einzigen wilden abgeleitet isolieren SC43. Werkzeuge für die Gentechnik wurden in diese axenic Stämme, was in der ersten veröffentlichten k.o. in 19874,5entwickelt. Protokolle wurden weiterentwickelt und optimiert für den Einsatz unter axenic Bedingungen6,7.

Anpassung dieser Protokolle zu Wildtyp D. Discoideum wurden Stämme, die nicht in der Lage, flüssige Brühe wachsen sind von mehreren Labors versucht. Dies ist jedoch nicht vollständig erfolgreich geworden, da die Transfektion Protokolle komplex sind und mangelnde Effizienz, teilweise aufgrund der Handlungsfähigkeit der Bakterien als Senke für die selektive Reagenzien8,9. Infolgedessen kommt im Wesentlichen alle molekulare Daten auf D. Discoideum aus Nachkommen von einem einzigen Wildtyp Isolat. Wir wollten diese Einschränkung zu überwinden und eine Methode, um unabhängig von ihrer Fähigkeit zu wachsen in flüssigem Medium D. Discoideum Zellen genetisch zu verändern. Die Notwendigkeit für ein solches Verfahren kann die Beobachtung erklärt werden, dass es in der Vergangenheit, die die Mutationen erlauben axenic Wachstum vor allem neutral waren ausgegangen und Zellphysiologie keinen Abbruch wurde. Diese Vermutung ist nur teilweise richtig. Im Allgemeinen gibt es zwei bemerkenswerte Unterschiede; zunächst isoliert zwischen den verschiedenen axenic Stämmen, und zweitens, wenn diese axenic Stämme mit nicht axenic wild Isolate8,9verglichen werden.

Vielleicht ist der kritischste Faktor der Schlüssel axenic-gen, AxtB, das vor kurzem als RasGAP NF1 identifiziert wurde. Die Hauptfunktion des NF1 als ein RasGAP Ras Aktivität3zurückhalten soll. Die Streichung des Enzyms in allen axenic Stämmen führt zu einer übermäßigen Ras Aktivität manifestiert als die Bildung von großen aktiven Ras-Patches. Diese erweiterten Ras-Patches führen zu die Ansammlung von PIP3 in der Plasmamembran. Diese zufälligen erscheinenden Flecken von PIP3 und aktiven Ras sind eine Vorlage für die Bildung von einem kreisförmigen Rüsche, die schließlich schließt und führt zur Bildung von Macropinosomes10. Die Folge ist eine übermäßige Zunahme der Macropinocytic Aktivität. Macropinocytosis ist ein Aktin-gesteuerten Prozess. Ein Wettbewerb für Zellskelett Komponenten für die Bildung von Macropinosomes oder Scheinfüßchen entsteht. Seinen Einfluss auf das Verhalten der Zelle spiegelt sich in der fast vollständige Verhinderung des Chemotaxis von vegetativen Zellen an Folat11. Die massiv erweiterten PIP3 Flecken sind sehr hartnäckig. Auch im ausgehungerten Zellen die PIP3 Patches bleiben und als Scheinfüßchen, die Interpretation von Studien über die Chemotaxis, cAMP Probleme verursachen können fehlinterpretiert werden können.

In einigen Fällen eignet sich die NF1 Mutation experimentell. Dies führt uns zu eine zweite Motivation für die Entwicklung einer Transfektion Methode für bakteriell gewachsenen D. Discoideum Zellen, da die Erhöhung Macropinocytosis axenic Zellen für die Untersuchung von grundlegenden Aspekte dieses Prozesses12 wertvoll macht . Jedoch haben Mutationen in den Genen für Macropinocytosis, wie z. B. Ras und PI3-Kinasen10, benötigt fast abgeschafft axenic Wachstum, machen es notwendig, diese Zellen durch Wachstum auf Bakterien zu manipulieren. Ein weiterer Grund, der Bakterien-basierte Transfektionen wertvoll macht ist der zunehmende Einsatz von Dictyostelids Fragen in der Entwicklung von Multi-Zellularität13,14, Kin Anerkennung15,16, und altruistische zellulären Verhalten, welches hauptsächlich davon abhängen, die Verwendung von frisch isolierte Wildtyp isoliert17. Alle genannten Forschungsbereiche durch effiziente Methoden zur Genmanipulation von wilden Isolaten gefördert werden können, die nicht axenic sind und wachsen nicht in flüssige Brühe.

Unsere Protokolle zulassen für die Überwindung der beschriebenen Einschränkungen. Zusammengenommen, die Möglichkeit der Durchführung von genetischer Manipulationen mit bakteriellen gewachsen D. Discoideum Zellen hält Vorteile für alle Dictyostelium Forscher, auch wenn es nur die erhöhte Geschwindigkeit des Auswahlverfahrens aufgrund schneller Wachstum der Amöbe (4 h Verdopplungszeit) auf Bakterien im Vergleich zu Wachstum in axenic Medien (10 h Verdopplungszeit).

Protocol

1. Vorbereitung der Zellen und Materialien SorMC-Puffer-Vorbereitung Bereiten Sie 100 mL 100 x SorMC (Sorensen Puffer einschließlich MgCl2 und CaCl2) Puffer durch 20,36 g KH2PO4 (15 mM) und 5,47 g Na2HPO4·7 H2O (2 mM) in 100 mL DdH2O Wasser auflösen. Rühren Sie die Lösung bei Raumtemperatur (RT) und bringen Sie die Lautstärke auf 100 mL mit dH2O.Hinweis: Die daraus resultierende Puffer hat einen pH von 6 und muss nicht weiter anpassen. 1000 mL 1 x Lösung in DdH2O. hinzufügen 50 µL jeder MgCl2 und CaCl2 Endkonzentrationen von 50 µM zu erreichen arbeiten zu produzieren. Filter zu sterilisieren die Lösung mit einem 0,22 µm-Filter.Hinweis: 1 X Puffer, Niederschlag der Salze in den 100 x Vorratslösung zu vermeiden immer fügen Sie MgCl2 und CaCl2 hinzu . Alternativ bereiten Sie KK2 Puffer (2,2 g KH2PO4 und 0,7 g K2HPO4 für 1 L Puffer) mit 50 µM MgCl2 ergänzt und 50 µM CaCl2 (im folgenden als KK2MC bezeichnet). Verwenden Sie diesen Puffer im gesamten anstelle von SorMC. Vorbereitung von Bakterien als Nahrungsquelle für D. discoideum Verwenden Sie eine einzige Kolonie von K. Aerogenes und impfen Sie 1 L LB-Medium (Lysogeny Brühe) zu. Verwenden Sie eine 2 L Flasche. Bakterien, die über Nacht bei 37 ° C mit Schütteln bei 220 u/min wachsen zu lassen.Hinweis: Wenn große Mengen von Bakterien erforderlich sind, verwenden Sie reichere Medien wie 2xTY (Hefeextrakt Tryptone Medium) oder SOB (super optimale Brühe) anstelle von LB. Für den Fall, dass die Verwendung von K. Aerogenes Bakterien aufgrund von Sicherheitsbeschränkungen nicht zulässig ist, kann stattdessen BL21 E. Coli verwendet werden. Ernten Sie die Zellen am nächsten Tag durch Drehen sie sich in zwei 500 mL Zentrifuge Röhren ~ 6.600 x g für 20 min. Waschen Bakterien einmal mit 500 mL SorMC-Puffer. Das Pellet in 20 mL SorMC aufzuwirbeln. Überprüfen Sie die OD600 (Extinktion bei 600 nm) mit einem Photometer. Mit dem gleichen Puffer auf eine OD600 rund 100 verdünnen.Hinweis: K. Aerogenes Bakterien sind schwer zu Pellets, so ist eine relativ hohe Geschwindigkeit für das Drehen der Bakterien notwendig um Lebensmittel Bakterien zu vermeiden. Die daraus resultierende bakterielle Stammlösung kann bis zu 4 Monate im Kühlschrank bei 4 ° C gelagert werden und pflegen ihre Nützlichkeit als Nahrungsquelle für D. Discoideum. 1 L Übernachtungen K. Aerogenes Aufhängung angebaut in LB-Medium in der Regel ergibt 20 mL eines OD600 rund 100.Vorsicht: Um sicherzustellen, dass die vorbereiteten Bakterien eine Monokultur von K. Aerogenes, führen Sie alle Schritte unter einer Haube. Vorbereitung der H40 Elektroporation Puffer 100 mL Pufferlösung vorbereiten, 0,952 g HEPES im DdH2O Wasser auflösen und aus einer Stammlösung 1 M 100 µL MgCl2 hinzufügen. Passen Sie auf pH 7 mit KOH für die Titration. Sterilisieren Sie den Puffer mit einem 0,22 µm Filter oder Autoklaven. Verwenden Sie säurefreie HEPES und nicht das Natriumsalz. Führen Sie Plasmid Vorbereitung des Herstellers Protokoll und mit den Kits in die Tabelle der Materialienzusammengefasst. Verwenden Sie die Plasmiden in Tabelle 1zusammengefasst.Hinweis: Die Qualität von DNA verwendet zur Transfektion ist entscheidend. Die Auswahl von D. Discoideum Transfectants auf Bakterien wachsen hat spezifische Anforderungen für die Projektträger die Auswahl und Ausdruck Kassette fahren (siehe Diskussion). Plasmid-name Resistenzselektion bei Bakterien Resistenzselektion in Dictyostelium Tag extrachromosomale Ausdruck Plasmide pDM1203 Ampicilin G418 Nein pDM1207 Ampicilin G418 N-terminale GFP pDM1208 Ampicilin G418 N-terminalen mCherry pPI159 Ampicilin G418 N-terminalen mNeon pPI437 Ampicilin G418 N-terminalen mScarlet pPI54 Ampicilin G418 N-terminalen mTurquoise2 pDM1209 Ampicilin G418 C-terminale GFP pDM1210 Ampicilin G418 C-terminalen mCherry pPI143 Ampicilin G418 C-terminalen mNeon pPI459 Ampicilin G418 C-terminalen mScarlet pPI142 Ampicilin G418 C-terminalen mTurquoise2 Shuttle-Plasmide pDM344 Ampicilin Nein Nein pDM1019 Ampicilin Nein N-terminale GFP pDM1018 Ampicilin Nein N-terminalen mCherry pPI152 Ampicilin Nein N-terminalen mNeon pPI418 Ampicilin Nein N-terminalen mScarlet pPI150 Ampicilin Nein N-terminalen mTurquoise2 pDM1021 Ampicilin Nein C-terminale GFP pDM1020 Ampicilin Nein C-terminalen mCherry pPI153 Ampicilin Nein C-terminalen mNeon pPI457 Ampicilin Nein C-terminalen mScarlet pPI151 Ampicilin Nein C-terminalen mTurquoise2 induzierbaren extrachromosomale Ausdruck Plasmide pDM1038 Ampicilin Hygromycin Nein pDM1047 Ampicilin Hygromycin N-terminale GFP pDM1046 Ampicilin Hygromycin N-terminalen mCherry pPI450 Ampicilin Hygromycin N-terminalen mNeon pPI452 Ampicilin Hygromycin N-terminalen mScarlet pPI449 Ampicilin Hygromycin N-terminalen mTurquoise2 pDM1049 Ampicilin Hygromycin C-terminale GFP pDM1048 Ampicilin Hygromycin C-terminalen mCherry pPI470 Ampicilin Hygromycin C-terminalen mNeon pPI460 Ampicilin Hygromycin C-terminalen mScarlet pPI469 Ampicilin Hygromycin C-terminalen mTurquoise2 act5 sicherer Hafen targeting Plasmide pDM1501 Ampicilin Hygromycin Nein pDM1513 Ampicilin Hygromycin N-terminale GFP pDM1514 Ampicilin Hygromycin N-terminalen mCherry pPI231 Ampicilin Hygromycin N-terminalen mNeon pPI419 Ampicilin Hygromycin N-terminalen mScarlet pPI228 Ampicilin Hygromycin N-terminalen mTurquoise2 pDM1515 Ampicilin Hygromycin C-terminale GFP pDM1516 Ampicilin Hygromycin C-terminalen mCherry pPI230 Ampicilin Hygromycin C-terminalen mNeon pPI458 Ampicilin Hygromycin C-terminalen mScarlet pPI229 Ampicilin Hygromycin C-terminalen mTurquoise2 REMI Ausdruck Plasmide pDM1220 Ampicilin Hygromycin Nein pDM1351 Ampicilin Hygromycin N-terminale GFP pDM1259 Ampicilin Hygromycin N-terminalen mCherry pPI465 Ampicilin Hygromycin N-terminalen mNeon pPI468 Ampicilin Hygromycin N-terminalen mScarlet pPI466 Ampicilin Hygromycin N-terminalen mTurquoise2 pDM1352 Ampicilin Hygromycin C-terminale GFP pDM1305 Ampicilin Hygromycin C-terminalen mCherry pPI471 Ampicilin Hygromycin C-terminalen mNeon pPI467 Ampicilin Hygromycin C-terminalen mScarlet pPI472 Ampicilin Hygromycin C-terminalen mTurquoise2 gezielt im Rahmen Plasmide pDM1355 Ampicilin Hygromycin C-terminale GFP pPI461 Ampicilin Hygromycin C-terminalen mCherry pPI462 Ampicilin Hygromycin C-terminalen mNeon pPI464 Ampicilin Hygromycin C-terminalen mScarlet pPI463 Ampicilin Hygromycin C-terminalen mTurquoise2 Knock-out-Plasmide pDM1079 Ampicilin Blasticidin Nein pDM1080 Ampicilin Nourseothricin Nein pDM1081 Ampicilin Hygromycin Nein pDM1082 Ampicilin G418 Nein CRE Ausdruck Plasmide pDM1483 Ampicilin Nourseothricin Nein pDM1489 Ampicilin Hygromycin Nein pDM1488 Ampicilin G418 Nein Tabelle 1: Plasmid-Liste für nicht-axenic Transfektionen. Einrichten von Dictyostelium Zellen zur Transfektion K. Aerogenes , Zusammenfluss in SM-Medium (nährstoffreiche Medium) wachsen über Nacht bei RT Kulturen kann bis zu 2 Wochen bei 4 ° c gelagert werden Fügen Sie etwa 400 µL dieser Bakteriensuspension auf eine SM-Agar-Platte (Pepton 10 g/L; Hefe Extrakt 1 g/L; Glucose 10 g/L; KH2PO4 1,9 g/L; K2HPO4 x 3 H2O, 1,3 g/L; MgSO4 wasserfreie 0,49 g/L; 1,7 % Agar) und gleichmäßig verteilt. Nehmen Sie eine sterile Schleife und impfen mit Dictyostelium Zellen. Verbreiten Sie die Zellen an einer Kante der Platte. Inkubieren Sie die Platte bei 22 ° C für 2 Tage, um ausreichend große Wachstumszonen zur Transfektion zu gewährleisten.Hinweis: Für Dictyostelium Stämme, die nicht machen große Wachstumszonen (z. B. Ax3, DH1 oder JH10) oder verwenden Sie für unerfahrene Experimentatoren, clearing-Platten statt. Folgen Sie hierzu die Anweisungen in den Schritten 1.5.4 auf 1.5.6. Nehmen Sie eine sterile Schleife und impfen mit Dictyostelium Zellen (ca. 2-4 x 105 Zellen). Übertragen Sie die Zellen auf 800 µL von einer dichten K. Aerogenes Aufhängung im infrarotem Mix Zellen durch Pipettieren rauf und runter. Übertragen Sie 400 µL, 200 µL, 100 µL und 50 µL auf frischen SM Agarplatten. Fügen Sie auf jeder Platte 400 µL des SM K. Aerogenes Zusatzfederung, gleichmäßig verteilt und trocknen. Ca. 2 Tage, bis die Platten durchscheinend werden inkubieren Sie die Platten bei 22 ° C.Hinweis: Aufgrund ihrer schnelleres Wachstum der Bakterien produzieren zunächst einen konfluierende Rasen und die Amöben anschließend “clear” die Platte der Bakterien. Der Zeitaufwand für diesen Prozess kann je nach Sorte Hintergrund und Fähigkeit des Mutantenzellen wachsen auf Bakterien unterscheiden. 2. die Transfektion von Dictyostelium Zellen basierend auf bakterielle Auswahl Abbildung 1 : Workflow für die Transfektion von Bakterien gewachsen Dictyostelium Zellen. Die Schritte zur Transfektion sind folgendermaßen aufgeführt. Wachsen Sie D. Discoideum Zellen auf einer SM-Platte mit K. Aerogenes Bakterien ausgesät (rot). Ernten Sie Zellen nur frontseitig Fütterung (grün), Vermeidung von Zellen, die bereits (dunkelgrün) entwickeln. Waschen Sie die Zellen im H40. Aufschwemmen Sie Zellen zu einer endgültigen Dichte von 2-4 x 107 Zellen/mL. Mischen Sie die Zellsuspension mit 1-2 µg DNA. Übertragen Sie die Mischung auf eine Elektroporation Küvette und Puls-Zellen. Übertragen Sie die Zellen direkt nach Electroporation in eine Schale mit SorMC und Bakterien. Lassen Sie die Zellen, die für 5 h zu erholen, bevor Sie die auswählbare Markierung hinzufügen. Fügen Sie für extrachromosomale Plasmide die Auswahl direkt in die Schale hinzu. Transfectants sind in der Regel nach ~ 2 Tage. Richten Sie für linearisierte Konstrukte, die für einzelne Integration in das Genom darauf abzielen drei Verdünnungen wie angegeben und fügen Sie die Auswahl hinzu. Bakterien stammen aus der OD600 = 100 Stammlösung. Die Rohre gut mischen und die Zellen in flach-Boden 96-Well-Zellkultur-Platten übertragen. Verwenden Sie zwei Platten pro Verdünnung. Pipette 150 µL Zellsuspension in jedem Brunnen. Es dauert etwa 5 Tage bis enge Kolonien sichtbar sind. Die roten Brunnen zeigen ein Beispiel für die übliche Zeitspanne erfolgreich transformierten Zellen gewonnen (obere Leiste geändert vom vorherigen Veröffentlichung22). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Um Platten mit K. Aerogenes Federung vorzubereiten, fügen Sie 10 mL SorMC Puffer mit K. Aerogenes Bakterien zu einer Dichte von OD600 = 2 (fügen Sie 200 µL des vorbereiteten OD600 = 100 K. Aerogenes -Stammlösung für die gewünschte Bakterien-Konzentration) Gewebekultur behandelt in einer 10 cm Petrischale.Hinweis: Diese Platte wird später benötigt, um den transfizierten pflegen D. Discoideum Zellen. Alternativ kann eine 6-Well-Zellkultur-Platte verwendet werden. Bei Transfektion von extrachromosomale Plasmide ist die 6-Well-Zellkultur-Platte ressourceneffizienter. Verwenden Sie 2 mL K. Aerogenes SorMC (OD600 = 2) Aufhängung pro Bohrloch. Vorbereitung von Dictyostelium Zellen Mit einer 10 µL Einweg Inokulation Schleife, kratzen Sie Zellen aus der Wachstumszonen (ca. 3 cm) von der Kultur-Platte (Rand der gelöschte Bereich) aktivieren oder Deaktivieren der Platte. Übertragen Sie Zellen in einem 1,5 mL Röhrchen mit 1 mL eiskaltes H40 Puffer.Hinweis: Der Zeitpunkt der Ernte der Zellen von den clearing-Platten ist entscheidend. Ernte zu früh Erträge zu wenig eine Menge an Zellen, während der Ernte bis zur späten erhöht entwickelt das Risiko einer teilweise nachgeben Zellen. Waschen der Zellen durch Drehen nach unten für 2 min bei 1000 x g oder Blitz-Spinnerei für 2 s bei 10.000 X g. Verwerfen Sie den Überstand und Aufschwemmen Sie Zellen in H40 Puffer zu einer endgültigen Dichte von 2-4 x 107 Zellen/mL. Halten Sie die Zellen während des gesamten Transfektion Verfahrens kühl. Verwenden Sie ein Eis-Wasser-Suspension, um einen direkten Kontakt der Rohre und Eis. Elektroporation Ein Rohr mit 1-2 µg DNA 100 µL Zellen hinzufügen. Umrühren Sie vorsichtig, von oben und unten pipettieren. Übertragen Sie die Zelle/DNA-Mischung in eine Küvette vorgekühlt Elektroporation (2 mm Abstand). Die Zellen mit den folgenden Einstellungen Rechtecksignal Puls: 350 V, 8 ms, 2 Impulsen und 1 s Impulsabstand.Hinweis: Fügen Sie nicht mehr als 2 µg DNA. Höhere Beträge sind giftig für Zellen und Transfektion Effizienz zu verringern. Die Summe hinzugefügt, dass DNA-Volumen 5 µL nicht überschreiten sollte. Zellen sofort die zuvor vorbereiteten 10 cm Petrischale mit K. Aerogenes SorMC und die Zellen für 5 h zu erholen.Hinweis: Überprüfen Sie die Zellen in der Petrischale unter einem inversen Mikroskop. Zellen direkt nach Electroporation Runde erscheint aber kehrt nach ca. 30 min, zum ihrer amöboiden Form wenn sie genug Zeit hatten, um richtig auf der Oberfläche zu befestigen. Auswahl an Transfectants: je nach ob Transfektion zu einem Knock-out-Knock-in, generieren, oder act5 Knock-in, oder eine fluoreszierende Reporter Protein aus einem extrachromosomale Plasmid ausdrücken ausgerichtet ist, das Auswahlverfahren durch eines durchführen im folgenden beschriebenen Verfahren.Hinweis: Im Gegensatz zu axenically gewachsenen Zellen sind bakteriell gewachsene Zellen sehr widerstandsfähig gegen Blasticidin. Auswahl, daher erfolgt stets mit G418 oder Hygromycin (siehe Diskussion). Durchbrüche, Knock-ins und act5 Knock-ins Lösen Sie die Zellen vorsichtig von der Petrischale, indem immer wieder zwingen die Flüssigkeit aus einer Pipette auf die Oberfläche. Richten Sie drei Verdünnungen in der SorMC K. Aerogenes Suspension (OD600 = 2) und fügen Sie dem selektierenden Agens nach den Widerstand (siehe Abbildung 1). Geringe Verdünnung: 9 mL Zellsuspension mit 20,4 mL SorMC und 600 µL der Stammlösung K. Aerogenes mischen. Mittlere Verdünnung: 900 µL Zellsuspension mit 28,5 mL SorMC und 600 µL der Stammlösung K. Aerogenes mischen. Hoher Verdünnung: 90 µL Zellsuspension mit 29,3 mL SorMC und 600 µL der Stammlösung K. Aerogenes mischen. Fügen Sie 30 µL auswählbare Markierung (100 x Stammlösung). Verteilen Sie die vorbereiteten Verdünnungen in flach-Boden 96-Well-Zellkultur-Platten durch Pipettieren 150 µL Zellsuspension in jede Vertiefung.Hinweis: Dieses Verfahren zielt darauf ab, einzelne Klone Bildschirm anstatt Populationen. Die Auswahl erfolgt etwa 5-7 Tage, je nach dem Konstrukt verwendet. Extrachromosomale Plasmide Die auswählbare Markierung 10 mL Schale direkt hinzufügen (siehe Abbildung 1).Hinweis: Gibt es keine Notwendigkeit, Verdünnungen, einrichten, da gibt es keine Lust auf klonalen Populationen. Das Auswahlverfahren für extrachromosomale Plasmide soll schneller hohe Kopienzahl in D. Discoideum Zellen vorhanden. Transfectants nach 32 h an 2 Tagen rechnen.Achtung: Die Antibiotika als auswählbare Markierung sind giftig. Tragen Sie Handschuhe. Die erhaltenen Klone für positive Tranfectants Bildschirm. Knock-out- oder Knock-in Versuche folgen Sie den Anweisungen in Schritt 2.5.1. Überprüfen Sie die Transfektion Erfolg für extrachromosomale Plasmide mit den Anweisungen in Schritt 2.5.2. Führen Sie für Durchbrüche, Knock-ins und act5 Knock-ins gelangen auf das Einstiegsbild über PCR, Integration des Konstrukts in der richtigen genomischen Lokus zu bestätigen.Hinweis: Um die Wahrscheinlichkeit einer klonalen Populationen zu maximieren, verwenden Sie die höchste Verdünnung möglich, die Transfectants nach Auswahl ergibt. Ziel für Platten, die maximal ein Drittel der Brunnen besetzt sind. Erweitern klonale Populationen übertragen Sie Klone, die nach Auswahl aus der Gewebekultur 96-Well-Platte in eine 12-Well-Zellkultur-Platte genügend Zellen für die Isolierung der genomischen DNA weiter gewachsen. Jedes gut mit 1 mL SorMC K. Aerogenes zu versorgen (OD600 = 2) und frische auswählbare Markierung.Hinweis: 1 Tag ist in der Regel ausreichend, um einen Zusammenfluss gut geeignet für die DNA-Isolierung zu erhalten. Um Mini genomische DNA isoliert auszuführen, die Zellen eines konfluierende gut zu ernten und genomischen DNA mit einem Mini-DNA Extraktion Kit nach den Anweisungen des Herstellers zu isolieren. Verwenden Sie die isolierte genomische DNA zusammen mit geeigneten Primern und Taq-Polymerase (siehe Tabelle der Materialien), PCR-Bildschirm für positive Integranden.Hinweis: Nach Bestätigung der positiven Integration in der richtigen genomischen Lokus sollte eine südlicher Fleckanalyse durchgeführt werden. Dies sorgt für mehr Vertrauen, dass zusätzliche Einfügung Veranstaltungen in unspezifischen genomische Regionen nicht aufgetreten. Für Reporter fluoreszierende Proteine visuell identifizieren Sie positive fluoreszente-Zellen zu und überprüfen Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop. Alternativ führen Sie ein western-Blot mit Antikörpern geeignet für biochemische Identifikation. PCR-Programm Schritt Temperatur Zeit Anfängliche Denaturierung 94 ° C 30 s 30 Zyklen 94 ° C 15-30 s 42 ° C 15-60 s 68 ° C 1 min/kb Letzte Erweiterung 68 ° C 5 min Halten 4-10 ° C Zusammensetzung der Reaktion Komponente 25 μL Reaktion Endkonzentration 10 µM forward Primer 0,5 ΜL 0,2 ΜM Rückwärts-Primer 10 µM 0,5 ΜL 0,2 ΜM Schablone DNA Variable (ca. 5 µL) < 1.000 ng 2 x Master Mix mit Standard-Puffer einschließlich Polymerase (siehe Tabelle der Materialien) 12,5 ΜL 1 x Nuklease-freies Wasser zu 25 µL < 1.000 ng Tabelle 2: PCR-Programm und Probe Zusammensetzung für die Verstärkung der D. Discoideum genomischer DNA.

Representative Results

Extrachromosomale Plasmide dienen Reporter Studien, die darauf abzielen, die Lokalisierung bestimmter Proteine in einer Zelle oder Veränderungen in der Zellstruktur der mutierten Zellen zu identifizieren. Für viele Ansätze, wie die Überwachung des Zellzyklus ist es wichtig, zwei Reporter zur gleichen Zeit auszudrücken. Dies ist jetzt möglich mit unserem dual Reporter extrachromosomale Plasmid System (Tabelle 1). Am 1. Tag wurden Zellen transfiziert vor dem Hinzufügen des wählbaren Markers G418 nach 5 h (Abbildung 1). In dem Beispiel SC4, DdB, Ax2 und unabhängig voneinander abgeleiteten wild Isolate V12M2 und WS2162 (zusätzliche Tabelle1) wurden mit dem Plasmid pPI289, die kodiert für GLP-TubulinA, ein Marker für die Mikrotubuli und mCherry-PCNA, ein Protein, das transfiziert zur Überwachung des Zellzyklus (Abb. 2A) eingesetzt. Nach 32 h wurden die Zellen unter dem Mikroskop beobachtet. Der Großteil der Zellen sowohl fluoreszierende beschriftet Fusionsproteine ausgedrückt meldet konsistent mit früheren diesen Ausdruck von zwei Reporter aus den gleichen Plasmid zeigt ähnliche Ausdruck, was fast unmöglich ist, bei der Verwendung von zwei unterschiedlichen Plasmide 18,19. Eine repräsentative Zelle für jede Zelllinie (SC4, DdB, Ax2, V12M2 und WS2162) mit dem Ausdruck der gewünschten dual Reporters in Abbildung 2Bdargestellt ist. Die Transfektion Wirkungsgrade sind in Abbildung2 Czusammengefasst. SC4-abgeleitete Zell-Linien zeigen die besten Transfektion Wirkungsgrade. Für Zell-Linien V12M2 und WS2162, wurde jedoch eine deutlich hohe Anzahl von Transfectants erhalten. Abbildung 2 : Ausdruck einer extrachromosomale Plasmid. (A) extrachromosomale Plasmide sind direkt in Kreisform transfiziert. Als Beispiel ist der dual Reporter pPI289 gezeigt. Die NgoMIV Orte anzugeben Einfügung der zweiten Reporter in die extrachromosomale Expressionsplasmid. (B) Z-Projektion einer repräsentativen Zelle GFP-TubulinA (zytoplasmatischen) und mCherry-PCNA (weitgehend nuklearen) für fünf unterschiedliche Wildtyp Zelllinien verwendet (SC4, DdB, Ax2, V12M2, WS2162) zum Ausdruck bringt. (C) die Transfektion Wirkungsgrade für die fünf Zell-Linien im Bild (b) wurden berechnet. Dargestellt ist der Mittelwert der beiden Experimenten. Fehlerbalken zeigen ± SD Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur. Integration von einem Targetingvektor in einen angegebenen genomischen Locus ist schwieriger und erfordert eine sorgfältigen Analyse der generierten Zelllinie. In Abbildung 3wird eine act5- mCherry KI in SC4 versucht. Erstens muss das Plasmid linearisiert werden, um die Häufigkeit der Rekombinationsereignisse nach Transfektion erhöhen. Hierzu wird das Plasmid pDM1514 mit NgoMIV geschnitten. Zwei Bands erhalten Sie nach dem Ausführen des Digests auf einem Agarosegel. Die 4127 bp-Band enthält das gewünschte Konstrukt (Abbildung 3). Zur Transfektion die verdaute DNA aus dem Gel extrahiert werden muss und gereinigt mit einem Gel Extraction Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Abbildung 3 : Vorbereitung von act5 Knock-in und DNA zur Transfektion. Ein Beispiel für die Verwendung einer 5 handeln-Knock-in das Plasmid pDM1514. Die Schritte zur Vorbereitung sind wie folgt. (A) vor der Elektroporation, linearisieren das Plasmid mit dem angegebenen Ngo-MIV-Sites. (B, C) Führen Sie die geschnittenen Plasmid auf ein Agarosegel aus, bevor die beiden erwarteten Bands richtig getrennt sind. Schneiden Sie die 4127 bp Band enthält die Rekombination Arme, mCherry und der Widerstand-Kassette und Gel die DNA extrahieren. Die DNA ist nun bereit zur Transfektion. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Die gereinigte DNA wurde für die Transfektion von SC4 Zellen verwendet. Nach ca. 5-6 Tagen Auswahl wurden Klone erhalten. Repräsentative Transfektion Wirkungsgrade und die Höhe der positiven identifizierten Klone für mehrere act5 Knock-Versuche sind in Tabelle 3zusammengefasst. Zwei Klone von SC4 Transfektion wurden nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und analysiert mittels PCR (Abb. 4A), und beide zeigten die vorhergesagten Band Muster erwartet ein Knock-in und weitere validiert mit südlicher Fleckanalyse zu eine einzige Integration zu gewährleisten Veranstaltung des Konstrukts in der Genom-20. Der Blot zeigt eine klare einheitliche Integration in die gewünschte act5 Locus (Abbildung 4B). Die erzeugten NC4::act5-mCherry -Zell-Linie kann jetzt in Experimenten verwendet werden. Abbildung 4 : Validierung der act5- mCherry KIs in SC4. (A) Regelung und Steuerung PCRs zur Validierung von positiven Integrationen in act5 Locus. Die angegebenen Primer wurden verwendet, um zwei unabhängige Klone und die Eltern zu analysieren. Beide Klone zeigen die erwarteten Bands für den Widerstand-Kassette und nachgeschalteten (P1) oder upstream Primer (P2), die nicht in der elterlichen Belastung vorhanden sind. Die Primer-Kombination (P1/P2) bestätigt die korrekte Integration von mCherry und Widerstand Kassette act5 Locus. Der Wildtyp SC4 zeigt die erwarteten 2800 bp Band, während beide KI-Klone dieser Band fehlt und stattdessen ein PCR-Produkt über 1400 Basenpaare größer angezeigt. (B) Regelung für die verwendeten Beschränkungsauswahl und südlicher Fleck. Beide Knock-in-Klone zeigen die kleineren 3400 bp Band, das ist das Ergebnis der Integration des Konstrukts in den 5 handelnLocus, speziell die zusätzlichen BclWebsite ich in der Hygromycin-Resistenz-Kassette. Die Wildtyp Steuerelement zeigt die erwarteten 5,8 kb infolge der zwei nachgeschalteten befindet sich BclWebsites ich. Der Fleck war beschnitten und gespleißt aus Gründen der Übersichtlichkeit. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. gezielte Konstrukt in der act5 Lokus Plasmid-name Anzahl der besetzten Brunnen Anzahl der aufgegebenen Klone Positive Klone Richtige Klone (%) Verwendete Dictyostelium-Stamm Transfektion Effizienz (Transfectants / 2 x 10 ^ 6/1 µg DNA) LifeAct-mCherry pPI226 7 7 1 14.2 AX2 3.5 x 10 ^-6 LifeAct-GFP pPI227 12 12 5 41,6 AX2 6 x 10 ^-6 GFP pDM1513 3 3 2 66,6 AX2 1,5 x 10 ^-6 mCherry pDM1514 3 3 1 33.3 AX2 1,5 x 10 ^-6 GFP pDM1513 66 9 5 55,5 AX2 3.3 x 10 ^-5 mCherry pDM1514 221 12 10 83,3 AX2 1.1 x 10 ^-4 H2B-mCherry pPI420 3 3 1 33.3 AX2 1,5 x 10 ^-6 H2B-mCherry pPI420 7 7 6 85,7 AX2 3.5 x 10 ^-6 mCherry pDM1514 10 10 7 70 DdB 5 x 10 ^-6 mCherry pDM1514 240 12 11 91,6 DdB 1.2 x 10 ^-4 mCherry pDM1514 320 12 12 100 SC4 1.6 x 10 ^-4 Tabelle 3: Transfektion Wirkungsgrade und die Höhe der erhaltenen positiven Transfectants zur Erzeugung von act5 KIs in anderen Stamm Hintergründe 22 . Die 5 handelnLocus bietet relativ homogenen Ausdruck der integrierten Reporter21. Die erzeugten NC4::act5-mCherry -Zellen ermöglichen Mischung Experimente mit anderen act5 Knock-ins mit einem verschiedenen fluoreszierenden Proteins wie GFP durchgeführt werden. Den großen Vorteil dieses Systems zu betonen, sind mischen Experimente mit Ax2::act5-GFP gezeigt. Aufgrund der Unfähigkeit, nicht axenic Wildtyp Zellen zu transfizieren könnte diese Art von Ansatz nicht vor durchgeführt werden. Mix Experimente sind ein wichtiges Instrument zur Zelle Verhalten zu analysieren, denn sie ermöglichen einen direkten Vergleich zwischen verschiedenen Zelllinien, die identische Versuchsbedingungen zu erleben. SC4 Zellen wachsen schneller auf bakterielle Rasen als Ax2 Zellen (Abb. 5A). Dies ist möglicherweise aufgrund einer höheren Kapazität zu phagozytieren Bakterien oder verbesserte Fähigkeit zu bewegen und zeigen Chemotaxis gegenüber eine Nahrungsquelle. Verwenden ein unter Agar Folat Chemotaxis-Assays, wurde eine Bevölkerung von NC4::act5-mCherry und Ax2::act5-GFP im direkter Vergleich durchgeführt, zeigen, dass NC4::act5-mCherry sind sehr viel effizienter in der Sensorik Folat. Nach 4 h konnten weitere NC4::act5-mCherry -Zellen kriechen unter die Agarose als Ax2::act5-GFP Zellen (Abb. 5B). Standard Analyse von Chemotaxis für die Zellen unter der Agarose Migration ergab, dass NC4::act5-mCherry -Zellen schneller waren und stärkere chemotaktische Reaktion als Ax2::act5-GFP Zellen (Abbildung 5C-E zeigten ). Abbildung 5 : Mit 5 handelnKIs für Image-basierte Chemotaxis Mischung Experimente. (A) NC4::act5-mCherry und Ax2::act5-GLP mit dem Ausdruck das angegebene fluoreszierende Protein aus den 5 handelnLocus für die Fähigkeit, auf eine bakterielle Rasen wachsen analysiert wurden. Nach 4 Tagen wurden die Plakette Durchmesser entstanden aus einsamen vergoldeten Dictyostelium Zellen gemessen. Non-axenic act5:: SC4 Zellen machen deutlich größeren Plaques als axenic Ax2::act5-GFP -Zellen (± SD bedeuten *** p < 0,0001, n = 3, 5 mm Maßstab). (B) für die Nutzung der unter Agarose Folat Chemotaxis assay22 , die chemotaktische Fähigkeiten des NC4::act5-mCherry und Ax2::act5-GFP verwendet in (A) direkt zu vergleichen, Bakterien-Amöben beider Stämme gewachsen waren gemischt im Verhältnis 50: 50. Zellen durften kriechen unter die Agarose. Nach 4 h wurden die Zellen, die die Folsäure Steigung Migration waren abgebildet mit einem konfokalen Mikroskop. Dann wurde die Anzahl der NC4::act5-mCherry und Ax2::act5-GFP Zellen bestimmt. NC4::act5-mCherry -Zellen waren effizienter in der Sensorik Folat. Über 10-divisibel mehr NC4::act5-mCherry Zellen fanden im Vergleich zu Ax2::act5-GFP Zellen (± SD bedeuten *** p < 0,0001, n = 6, Skala bar 100 µm). (C, D) Die Zellen wurden für 60 min. gefilmt, und ihre Geschwindigkeit und chemotaktische Index berechnet wurden. Nach einer Vorauswahl der meisten chemotactically reagieren Zellen (nur diejenigen, die unter die Agarose migriert), Zellen Ax2::act5-GFP zeigten niedrigere Werte für Zelle Geschwindigkeit und Chemotaxis. Fünfzig Zellen pro Zell-Linie wurden analysiert. (Median ± SD, * p < 0,01, n = 3). (E) die Spuren der NC4::act5-mCherry und Ax2::act5-GFPact5 Knock-ins werden über 60 min, zeigen mehr gerichtete Bewegung in Richtung der Chemoattractent Quelle der NC4::act5-mCherry Zellen gezeichnet (Median ± SD, ** * p < 0,0001, n = 6). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Die act5 Knock-in Zell-Linien können auch für Durchflusszytometrie verwendet werden. Wie bei Wachstum auf Bakterien, gibt es große Unterschiede in der Entwicklung axenic Stämme und nicht axenic Wildtypen. Nach der Entwicklung der Fruchtkörper SC4 Zellen sind etwa doppelt so groß wie die von Ax2 Zellen abgeleitet. Wenn Zellen gemischt werden, ergibt sich eine mittlere Größe Fruchtkörper. Um den Beitrag der beiden Zelllinien mehr quantitativ zu analysieren, wurde Durchflusszytometrie verwendet. Diese Analysen zeigten deutlich, dass die mittlere Fruchtkörper durch verschiedene Ebenen des Beitrags von beiden Zelllinien sind. Während NC4::act5-mCherry -Zellen bis zu ca. 75 % der gemessenen Sporen gebildet, trugen Ax2::act5-GFP nur 25 %, offenbart einen potenziellen Fitness-Vorteil für nicht-axenic-Stämme (Abbildung 6). Da die Analyse der Stiel-Zell-Population nicht überwacht, gibt es zwei Möglichkeiten, das Ungleichgewicht in der Entwicklung zwischen Ax2 und SC4 zu erklären. Eine Möglichkeit ist, dass Ax2 Zellen vor allem auf den Stiel-Zell-Population, anstatt die Spore-Zell-Population beitragen. Alternativ können mehr SC4-Zellen die Entwicklungen-Zyklus, mit Ax2 relativ verzögert, und sie sind daher nicht zu der Versammlung einen Fruchtkörper beitragen. Die Möglichkeit, nicht-axenic Wildtyp Zellen zu transfizieren andere Ansätze weiterentwickelt und experimentelle Verfahren erheblich vereinfacht. Abbildung 6: Act5 KIs erlauben eine Analyse der Mischung Experimente mit Durchflusszytometrie. (A) NC4::act5-mCherry und Ax2::act5-GFP wurden einzeln oder in einer 50: 50 Mischung auf Agarplatten-Nährstoff entwickelt. NC4::act5-mCherry Zellen bilden größere Fruchtkörper als Ax2::act5-GFP. Die Mischung zeigt stattdessen eine Zwischengröße (Skala 5 mm). Konfokale Fluoreszenzmikroskopie Licht schlägt vor, einen höheren Anteil an NC4::act5-mCherry Sporen in die Spore-Köpfe, abgeleitet aus den Mischungen. (B), diese Beobachtung, die Mengen von Sporen in der geernteten Spore zu quantifizieren, die Köpfe aus dem Mischpult Experiment in (A) durch Durchflusszytometrie analysiert wurden. Etwa 75 % der Sporen stammt aus NC4::act5-mCherry Zellen mit nur 25 % vom Ax2::act5-GFP Zellen. (C) repräsentative Verteilung der Sporen von beiden Zelllinien in einen Flow Cytometry Scatter gezeigt. Ca. 0,05 % zeigen positive mCherry und GLP signalisiert, was darauf hindeutet, dass parasexual Fusionsprozesse aufgetreten sind oder, dass Sporen in einander stecken. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Zell-Linie Genetisch Hintergrund Referenz-Nummer Veröffentlicht vor Typ AX2 (Ka) DBS0235521 Bloomfield Et Al., 2008 Wildtyp SC4 (S) Bloomfield Et Al., 2008 Wildtyp act5::mCherry Klon 5 SC4 HM1912 Paschke Et Al., 2018 act5 Knock-in act5::GFP Klon 2 AX2 HM1930 Paschke Et Al., 2018 act5 Knock-in V12M2 Bloomfield Et Al., 2008 Wildtyp WS2162 Bloomfield Et Al., 2008 Wildtyp Ergänzende Tabelle1: verschiedene Stämme von Dictyostelium studierte.

Discussion

Die Verwendung von nicht-axenic, Wildtyp Dictyostelium Zellen wurden nur sehr geringe so weit in der molekularen Forschung. Verfügbare Methoden für die Gentechnik dieser Stämme haben Zuverlässigkeit und Effizienz23, ihre allgemeine Annahme verhinderten fehlte. Die erzeugten Materialien und Protokolle, die hier vorgestellten einsetzbar für jede D. Discoideum Belastung unabhängig von seiner Fähigkeit im flüssigen Medium wachsen. Es sei darauf hingewiesen, dass dieses Protokoll für SC4-abgeleitete Zellinien optimiert ist. Transfektion Wirkungsgrade für frisch isolierten Stämme aus der freien Wildbahn unterscheiden sich von SC4, wie wir beobachtet haben, vor und werden hier für V12M2 und WS21628,9gezeigt. Die Elektroporation Bedingungen scheinen insbesondere einen erheblichen Einfluss auf die Effizienz der Transfektion und erfordern weitere Optimierung für einige Stämme. In der Regel eine ausreichende Menge an Transfectants eingehalten worden in alle Sorten getestet bisher zeigen, dass diese Methoden durchführbar sind. Die Anzahl der positiven Transfectants SC4-abgeleitete Stämme mit Hilfe anderer nicht axenic Wildtyp Stämme, sondern in allen Fällen höher verglichen wird, sind Transfectants in ausreichender Zahl erhalten, um für weitere Experimente zu ermöglichen. Dies, plus die Einfachheit unseres Protokolls ist die wesentliche Verbesserung im Vergleich zu früheren Versuche8,9.

Diese neue nicht-axenic Protokolle decken alle genetischen Standardverfahren und fügen Sie weitere Vorteile, da Transfektionen parallel rasch und effizient durchgeführt werden können. Positive Klone erhalten Sie in Tagen statt Wochen, da Wachstum auf Bakterien Hälften der Sparte Zeit. Die neu gegründete Plasmide auch arbeiten unter axenic Bedingungen und routinemäßig verwendet werden unter beiden Wachstumsbedingungen, die ist ein weiterer Fortschritt dieser Methology22. Wie im Protokoll eingeführt, das Plasmid zur Auswahl auf Bakterien haben spezielle Anforderungen, die für den Erfolg der Transfektion von entscheidender Bedeutung sind. Die Promotoren fahren die Meinungs- und Widerstand Kassetten sind insbesondere wichtig für erfolgreiche Transfektion. Die oft verwendete act6 (Aktin 6) Veranstalter24 für das fahren der Widerstand oder Ausdruck Kassetten fehlt Effizienz, wenn Zellen auf Bakterien gezüchtet werden. In unserem Plasmid-System fährt der hochaktiven act15 (Aktin 15) Veranstalter alle Expressionskassetten, während der Widerstand-Kassetten unter der Kontrolle eines Promotors coA (Coactosin A), sowohl sind von denen aktiv unter axenic Bedingungen und in Zellen, die auf Bakterien gezüchtet. Anforderungen für den Ausdruck der Reporter erstellt sowie Knock-in und Knock-out-Konstrukte machen es notwendig, unsere Plasmid-Repertoire zu benutzen, aber leider schränkt die Verwendung von Vektoren, die bereits erstellt, dass die Nutzung der ineffizienten act6 Projektträger.

Promotor Wirkungsgrade sind besonders wichtig für Transfektionen, die von einer einzigen Integration-Veranstaltung in der richtigen genomischen Lokus abhängen. Durch unsere Verbesserung der Promotoren fahren die Resistenz-Gen-Expression wird genügend Widerstand Protein aus einzelnen Lokus Integrationen hergestellt. Ein Hauptanliegen war die Begünstigung von mehreren Integrationen in das Genom, bei Verwendung von Hygromycin oder G418 wie beschrieben. Keine Begünstigung von mehreren Integrationen ist bisher, wie bereits berichtet für G418 Auswahlen mit älteren Förderer Systeme25beobachtet worden. Dies bedeutet, dass sowohl Hygromycin und G418 sind geeignete wählbaren Marker für die Erzeugung von sauberer Durchbrüche und Knock-VG leider nicht auswählbare Markierung Blasticidin funktioniert nicht axenic Bedingungen. Dies ist ein großer Nachteil unserer Methode, da die Blasticidin Widerstand Kassette routinemäßig verwendet, um Knock-out-Konstrukte in D. Discoideumzu generieren. Konstrukte, die bereits mit Blasticidin Widerstand Kassetten erstellt wurden müssen rederived werden unter Verwendung eines praktikablen wählbaren Marker. Eine andere Möglichkeit, diese Einschränkung zu überwinden ist, die kürzlich ins Leben gerufene axenic D. Discoideum CRISPR verbinden Technik mit diesem Transfektion Protokoll26. Die Generation geeignet, einzelne Guide RNAs (SgRNAs) ist einfacher und schneller als die Rekonstruktion der komplette Knock-out-Konstrukte. Für zukünftige Richtungen, die Möglichkeit mehrere Durchbrüche zu erzeugen mit CRISPR/Cas9 kombiniert mit diesem Protokoll Transfektion ist ansprechend und kann ebnen den Weg für viele Forscher in der Dictyostelium -Gemeinschaft. Die Verarbeitbarkeit des etablierten transiente Expressionssystems zur CRISPR/Cas9 in axenic gewachsenen Zellen sollten jedoch sorgfältig geprüft werden.

Das act5 Knock-in-System präsentiert bietet eine zuverlässige und sichere Integrationssystem zur Erzeugung von stabilen Zelllinien in D. Discoideum, mit dem Vorteil von ähnlichen Websites anderer Organismen22gegründet. Außerdem hängt von einer einzigen Integration Ereignis im Genom und bietet viele Möglichkeiten für verschiedene Forschungsrichtungen. Der act5 Projektträger ist stark aktiv und garantiert fast homogene Ausdruck27 unabhängig von den Anbaubedingungen. Fluoreszierende Reporter Proteine können diese sicherer Hafen-Locus mit veränderter targeting Plasmide leicht integriert werden. Dies ist nützlich, zum Beispiel für Handy-Tracking-Zwecke, wie hier in einem Mix-Experiment gezeigt. Die Zellen zeigen minimale Zelle zu Zelle Ausdruck Variabilität, die bei automatisierten Zelle tracking unterstützen kann. Wichtig ist, erscheint die Einfügung einer gewünschten Sequenz in den 5 handelnLocus phänotypisch neutral28,29. Wie der Ausdruck nicht auf eine auswählbare Markierung Proteinexpression, pflegen abhängt, wie in zufälligen Integrants oder extrachromosomale Vektor-Lager-Zell-Linien zu sehen, kann das act5 System für Rettung Experimente, sowie nützlich sein. Da die Zelllinien homogen sind, können alle Zellen analysiert werden. Dies ist nicht möglich mit einem extrachromosomale Plasmid für Ausdruck, in denen gibt es beträchtliche Heterogenität im Ausdruck.

Neben diesen allgemeinen Verbesserungen für alle Stämme ermöglicht das verwenden Sie nicht axenic Wildtyp Zellen für molekularbiologische Untersuchungen eine Bewertung der Auswirkungen der angesammelten Mutationen im aktuellen Laborbelastungen. Mehrere genetische Rearrangements ist seit der Verabschiedung des Stammes Ax2 1970 gefunden worden, wie zuvor veröffentlichten Microarray Analysen26gezeigt. Synthetische Phänotypen sind wegen des Vorhandenseins dieser Mutationen beobachtet. Beispielsweise zeigt eine gemeldete Phg2 Mutante verminderte Haftung in einem Labor Stamm Hintergrund und gesteigerte Adhäsion in einem anderen3. Solche widersprüchlichen Daten können jetzt durch Wiederholung des Experiments in der gemeinsame Vorfahr Belastung (in diesem Fall, DdB) gelöst werden. Die Stärke dieses Ansatzes hat sich vor kurzem für die kleine GTPase RasS30,31gezeigt.

Die Fähigkeit zur genetischen Experimente in jede Sorte von D. Discoideum erweitert das Potenzial der neuen Forschungsrichtungen, die die Verwendung von wilden Isolate, insbesondere solche, die gesellschaftliche Entwicklung, Kin Anerkennung und die sexuelle Zyklus22abhängen.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Kay Lab für die Eingabe in diese Methode und die LMB Mikroskopie und Flow Cytometry Einrichtungen für hervorragende wissenschaftliche und technische Unterstützung. Diese Arbeit durch Medical Research Council Grant MC_U105115237, R. R. Kay, BBSRC (Biotechnologie und biologische Wissenschaften Research Council) BB/K009699/1, R. R. Kay finanziert wurde, Cancer Research UK gewähren A15672 R. H. Insall, Wellcome Trust Senior Fellowship 202867/Z/16/Z Jonathan R Chubb und MRC Finanzierung (MC_U12266B) zum MRC LMCB Universität Gerät am UCL.

Materials

Equipment
Eppendorf Microcentrifuges 5424/5424R ThermoScientific 05-400-002
Eppendorf 5702R Centrifuges with A-4-38 Model Rotor ThermoScientific 12823252
Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal Cyclers Sigma Aldrich EP6331000025
Gene Pulser X Cell, including CE & PC modules BioRad 1652660
Safety Cabinet Foruna – SCANLAF Labogene
BioPhotometer Plus Eppendorf
CLSM 710 Zeiss
Media & Agaroses
LoFlo Medium Formedium LF0501
Seakem GTG Agarose Lonza 50071
Low EEO Agarose BioGene 300-200
Purified Agar Oxoid LP0028
SM broth Formedium SMB0102
2x LB broth Formedium LBD0102
Chemicals
SYBR Safe DNA Gel Stain ThermoScientific S33102
1 Kb Plus DNA Ladder ThermoScientific 10787018
1 Kb DNA Ladder NEB N3232L
HEPES free acid Sigma Aldrich/Merck 391340 EMD
KH2PO4 VWR P/4800/53
Na2HPO4 * 2 H2O VWR 10028-24-7
MgCl2 * 6 H2O Sigma Aldrich/Merck 5982 EMD
CaCl2 * 2 H2O Sigma Aldrich 442909
Folic Acid Sigma Aldrich F7876
KOH VWR 26668.263
Cultur Dishes
96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Low Evaporation Lid, Tissue Culture Treated Corning Incorporated 3595
6 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid, Tissue Culture Treated Corning Incorporated 3516
100 x 20 mm style Tissue Culture Dish, Tissue Culture Treated Corning Incorporated 353003
50 mm Glass Bottom Microwell Dishes No1.5 MatTek Corporation P50G-1.5-30-F
Antibiotics
Geneticin G418-sulphate Gibco by Life Technologies 11811-023
Hygromycin B Gold InvivoGen ant-hg-1
Additional Consumables
2mm gap electroporation cuvettes, long electrode Geneflow Limited E6-0062
10 µl Inoculating Loop, Blue 10 Micro L ThermoScientific 129399
Spreader, L-shaped, sterile greiner bio-one 730190
Combitips advanced 5 ml Eppendorf BIOPUR 30089669
Kits
ZR Plasmid Miniprep Classic Zymoresearch D4016
Quick DNA Miniprep Kit Zymoresearch D3025
Zymoclean DNA Recovery Kit Zymoresearch D40002
Enzymes
Restriction enzymes NEB
OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer NEB M0482L
T4 DNA Ligase NEB M0202S
PrimeSTAR Max DNA Polymerase TakaraBio R045A
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Riferimenti

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Paschke, P., Knecht, D. A., Williams, T. D., Thomason, P. A., Insall, R. H., Chubb, J. R., Kay, R. R., Veltman, D. M. Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria. J. Vis. Exp. (143), e58981, doi:10.3791/58981 (2019).
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