الهندسة الوراثية ديسكويديوم ديكتيوستيليوم "الخلايا استناداً إلى" التحديد والنمو في البكتيريا
Summary
ديسكويديوم ديكتيوستيليوم كائن نموذج شعبية لدراسة العمليات الخلوية المعقدة مثل الهجرة الخلية والالتقام، والتنمية. الأداة المساعدة للكائن الحي يتوقف على إمكانية التلاعب بالجينات. نقدم هنا، أساليب ترانسفيكت الخلايا ديسكويديوم ديكتيوستيليوم أن التغلب على القيود القائمة لتثقيف الخلايا في سائل الإعلام.
Abstract
ديسكويديوم ديكتيوستيليوم كائن حي نموذجية مثيرة للاهتمام لدراسة عمليات تمييز الخلية أثناء التنمية والخلية الإشارات والأسئلة الهامة البيولوجيا الخلوية الأخرى. التكنولوجيات المتاحة للتلاعب وراثيا بخلايا ديكتيوستيليوم متطورة جداً. ترانسفيكشنز يمكن أن يؤديها باستخدام علامات التحديد مختلفة وعلامة إعادة ركوب الدراجات، بما في ذلك جزئ مثلى والطفرات insertional. وهذا معتمد من قبل جينوم مشروحة جيدا. بيد أن هذه النهج هي الأمثل لخطوط الخلايا أكسينيك المتنامية في الثقافات السائل ويصعب من تطبيق غير أكسينيك البرية من نوع الخلايا، التي تتغذى على البكتيريا فقط. الطفرات التي تكون موجودة في سلالات أكسينيك تخل برأس الإشارات، مما تسبب في ماكروبينوسيتوسيس المفرطة المطلوبة لتغذية، وتضعف الهجرة الخلية، مما يفند تفسير توصيل الإشارة وتجارب إنزيمية في هذه السلالات. محاولات سابقة للتلاعب وراثيا بخلايا غير أكسينيك تفتقر إلى الكفاءة والإجراءات التجريبية المعقدة المطلوبة. قمنا بتطوير بروتوكول تعداء بسيطة، للمرة الأولى، ويتغلب على هذه القيود. هذه السلسلة من التحسينات الكبيرة في علم الوراثة الجزيئي ديكتيوستيليوم السماح بالتلاعب بها بسهولة كما سلالات مختبرية قياسية البرية من نوع الخلايا. بالإضافة إلى المزايا لدراسة عمليات الإشارات وحركية غير المعطوب، يمكن طفرات التي تعطل النمو القائم على ماكروبينوسيتوسيس الآن سهولة معزولة. وعلاوة على ذلك، سير العمل تعداء كامل هو تسارع إلى حد كبير، مع المؤتلف الخلايا التي يمكن أن تتولد في أيام بدلاً من أسابيع. هناك ميزة أخرى أن علم الوراثة الجزيئي كذلك يمكن أن يؤديها مع معزولة طازجة البرية من نوع ديكتيوستيليوم عينات من البيئة. وهذا يمكن أن تساعد على توسيع نطاق النهج المستخدمة في هذه المجالات البحثية.
Introduction
جنس ديكتيوستيليوم هي أميبا الحية التربة الاجتماعية التي تتغذى أساسا على البكتيريا. يتم وضعها في الأسرة في اللغات متموريات، عدد كبير من الأنواع وقد تم عزل التي يمكن تجميعها في أربعة أطوار مختلفة1. وقد أصبح الأنواع ديسكويديوم ديكتيوستيليوم (ديسكويديوم د) كائن نموذج شعبية لدراسة العمليات الخلوية المعقدة مثل الهجرة الخلية والبلعمه. للتحكم وتوحيد الشروط التجريبية، خلية أكسينيك ووضعت الخطوط التي تستطيع أن تنمو في المتوسطة السائلة المعقدة أو تم تعريفها في حالة عدم وجود البكتيريا2. Ax2، Ax3، تكتسب أهمية خاصة، وعزل سلالات Ax4، التي كانت كلها ولدت في السبعينات وفي نهاية المطاف مستمدة من البرية واحد NC43. ووضعت أدوات للهندسة الوراثية في هذه السلالات أكسينيك، أسفر عن التقديم المنشورة الأولى في عام 19874،5. كذلك وضعت بروتوكولات والأمثل للاستخدام تحت ظروف أكسينيك6،7.
التكيف مع هذه البروتوكولات إلى البرية من نوع ديسكويديوم دال- حاولت السلالات التي لا تستطيع أن تنمو في المرق السائل من عدة مختبرات. ومع ذلك، هذا لا أصبحت ناجحة تماما منذ بروتوكولات تعداء معقدة وتفتقر إلى الكفاءة، وجزئياً بسبب قدرة البكتيريا على العمل كبالوعة لل8،الكواشف انتقائية9. نتيجة لذلك يأتي الأساس الجزيئي جميع البيانات المتعلقة ديسكويديوم د من أحفاد عزل البرية من نوع واحد. لقد أردنا للتغلب على هذا التحديد، ووضع طريقة لتعديل الخلايا ديسكويديوم دال- مستقلة عن قدرتها على النمو في المتوسط السائل وراثيا. ويمكن تفسير الحاجة إلى مثل هذا أسلوب بالملاحظة أنه كان يفترض في الماضي أن الطفرات مما يسمح بزيادة أكسينيك كانت محايدة أساسا ولا تنتقص من فيزيولوجيا الخلية. هذا الافتراض صحيح جزئيا فقط. وبصفة عامة، هناك اثنين من الاختلافات الملحوظة؛ أولاً، بين مختلف عزل سلالات أكسينيك، والثانية، وعند مقارنة هذه السلالات أكسينيك مع يعزل البرية غير أكسينيك8،9.
ولعل أكثر العوامل حسما هو الرئيسية أكسينيك الجينات، فاسب، التي اعتبرت مؤخرا NF1 راسجاب. المهمة الرئيسية ل NF1 راسجاب لكبح جماح رأس النشاط3. حذف الإنزيم في جميع سلالات أكسينيك يؤدي إلى النشاط المفرط رأس يتجلى كتشكيل بقع Ras نشطة كبيرة. هذه البقع Ras الموسع يؤدي إلى تراكم PIP3 في غشاء البلازما. هذه البقع الظهور مصادفة PIP3 ورأس النشطة هي قالب لتشكيل دائرية [روفل] أن يغلق في نهاية المطاف، ويؤدي إلى تشكيل ماكروبينوسوميس10. والنتيجة زيادة مفرطة في النشاط ماكروبينوسيتيك. ماكروبينوسيتوسيس عملية يحركها أكتين. مسابقة لمكونات سيتوسكيليتال للتشكيل أما ماكروبينوسوميس أو بسيودوبودس هو النتيجة. تأثيره على سلوك الخلية ينعكس في منع إنزيمية خلايا النباتية لحمض الفوليك11كاملة تقريبا. هذه البقع PIP3 الموسع على نطاق واسع جداً ثابتة. حتى في الخلايا المتعطشة، تظل البقع PIP3 ويمكن أن يساء تفسيره بسيودوبودس، الذي يمكن أن يسبب مشاكل تفسير الدراسات المتعلقة به إلى المخيم.
وفي بعض الحالات، أن الطفرة NF1 مفيد تجريبيا. وهذا يقودنا إلى حافز ثاني لتطوير أسلوب تعداء للبكتريا نمت ديسكويديوم دال- الخلايا، نظراً للزيادة في معدل ماكروبينوسيتوسيس يجعل الخلايا أكسينيك قيمة للتحقيق في الجوانب الأساسية لهذه العملية12 . ومع ذلك، ألغت الطفرات في الجينات المطلوبة ماكروبينوسيتوسيس، مثل PI3-مؤنزم ورأس10، تقريبا النمو أكسينيك، مما يجعل من الضروري التعامل مع هذه الخلايا من خلال النمو في البكتيريا. وهناك سبب آخر يجعل القائم على البكتيريا ترانسفيكشنز قيمة هو تزايد استخدام ديكتيوستيليدس لاستكشاف المسائل في التطور متعدد سيلولاريتي13،14، الاعتراف بالقربى15،16، ويعزل الإيثار سلوك الخلوية، التي تعتمد أساسا على استخدام البرية الطازجة معزولة من نوع17. جميع المذكورة يمكن تيسير مجالات البحث بأساليب تتسم بالكفاءة للتحوير الوراثي يعزل البرية، وهي غير أكسينيك ولا تنمو في المرق السائل.
لدينا بروتوكولات تسمح للتغلب على أوجه القصور الموصوفة. أخذت معا، إمكانية أداء التلاعبات الجينية مع البكتيريا نمت الخلايا ديسكويديوم دال- يحمل فوائد لجميع الباحثين ديكتيوستيليوم ، حتى لو أنها مجرد زيادة سرعة عملية الاختيار المقرر أن أسرع نمو الاميبا (ح 4 مضاعفة الوقت) على البكتيريا مقارنة بالنمو في وسائل الإعلام أكسينيك (10 ح مضاعفة الوقت).
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تم استخدام الخلايا ديكتيوستيليوم غير أكسينيك، والبرية من نوع محدودة جداً حتى الآن في الأبحاث الجزيئية. الأساليب المتاحة للهندسة الوراثية لهذه السلالات تفتقر إلى الموثوقية والكفاءة23، منع اعتمادها العام. يمكن استخدام المواد التي تم إنشاؤها والبروتوكولات المقدمة هنا لأي سلالة ديسكويديوم دال- مستقلة عن قدرته أن ينمو في المتوسط السائل. تجدر الإشارة إلى أن هذا البروتوكول هو الأمثل لخطوط الخلايا المستمدة من NC4. الكفاءة تعداء للسلالات المعزولة طازجة من البرية تختلف عن NC4، كما أننا لاحظنا قبل وترد هنا ل V12M2 و WS2162،من89. شروط انهانسر خاصة ويبدو أن لها تأثير كبير على الكفاءة تعداء وقد تتطلب مزيدا من التحسين لبعض السلالات. وبصفة عامة، لوحظت على كمية كافية من ترانسفيكتانتس في جميع سلالات اختبارها حتى الآن، تبين أن هذه الأساليب قابلة للتطبيق. عدد ترانسفيكتانتس الإيجابية التي تم الحصول عليها باستخدام سلالات المستمدة من NC4 أعلى بالمقارنة بغيرها من السلالات البرية من نوع غير أكسينيك، ولكن في جميع الحالات، يتم الحصول على العدد الكافي من ترانسفيكتانتس للسماح لمزيد من التجارب. هذا، بالإضافة إلى بساطة لدينا البروتوكول، وهو تحسن كبير مقارنة بمحاولات سابقة8،9.
تغطي جميع الإجراءات الجينية القياسية هذه البروتوكولات غير أكسينيك جديدة وإضافة المزيد من المزايا، حيث يمكن إجراء ترانسفيكشنز سرعة وكفاءة في نفس الوقت. يمكن الحصول على النسخ الإيجابية في أيام بدلاً من أسابيع، منذ نمو في النصفين البكتيريا الوقت شعبة. والبلازميدات المنشأة حديثا أيضا العمل في ظل ظروف أكسينيك، ويمكن بشكل روتيني استخدامها تحت ظروف النمو على حد سواء، وهو آخر النهوض بهذه الأساطير22. كما أدخلت في البروتوكول، قد بلازميد المستخدمة لاختيار على البكتيريا المتطلبات الخاصة التي تعتبر حاسمة بالنسبة لنجاح تعداء. على وجه الخصوص، المروجين القيادة شرائط التعبير والمقاومة هامة لنجاح تعداء. مروج غالباً ما تستخدم act6 (أكتين 6)24 للقيادة أشرطة الكاسيت المقاومة أو التعبير يفتقر إلى الكفاءة عندما تزرع الخلايا على البكتيريا. في نظامنا بلازميد، داعية نشطة للغاية act15 (أكتين 15) محركات جميع الأشرطة التعبير، بينما الأشرطة المقاومة تحت سيطرة أحد المروجين coA (كواكتوسين A)، سواء التي تنشط في ظل الظروف أكسينيك، وفي الخلايا المزروعة في البكتيريا. متطلبات للتعبير عن مراسل بنيات فضلا عن طريقة الكبس وثوابت المغلوب تجعل من الضروري استخدام مرجع بلازميد لدينا، ولكن للأسف يحد استخدام الموجهات التي تستخدم المروج الكفاءة act6 بالفعل بإنشاء.
الكفاءة المروج تكتسي أهمية حاسمة خاصة ترانسفيكشنز التي تعتمد على حدث واحد تكامل في موضع الجينوم الصحيح. سبب لنا تحسين المروجين القيادة تعبير الجينات المقاومة، ينتج ما يكفي من البروتين المقاومة من التكاملات محور واحد. وكان شاغلا رئيسيا تحابي تكاملات متعددة في مجال المجين عند استخدام هيجروميسين أو G418 كما هو موضح. لا تحابي تكاملات متعددة وقد لوحظ حتى الآن، كما ذكرت سابقا لتحديدات G418 باستخدام نظم المروج الأكبر سنا25. وهذا يعني أن كل من هيجروميسين و G418 علامات التحديد مناسبة لتوليد تدق الرافضة نظيفة وتدق ins. للأسف، بلاستيسيدين علامة التحديد لا يعمل تحت ظروف غير أكسينيك. هذا عيب رئيسي لأسلوبنا، منذ كاسيت المقاومة بلاستيسيدين تستخدم بشكل روتيني لإنشاء بنيات المغلوب في ديسكويديوم د. الثوابت التي تم إنشاؤها بالفعل مع أشرطة المقاومة بلاستيسيدين ستحتاج إلى أن يكون ريديريفيد باستخدام واحدة من علامات التحديد قابلة للتطبيق. وثمة إمكانية أخرى للتغلب على هذا القيد الجمع بين أكسينيك أنشئت مؤخرا ديسكويديوم دال كريسبر التكنولوجيا مع هذا البروتوكول تعداء26. جيل مناسبة، واحدة دليل الكشف (سجرناس) أبسط وأسرع من إعادة بناء كاملة بنيات المغلوب. لاتجاهات المستقبل، إمكانية توليد عدة طرق الرافضة استخدام كريسبر/Cas9 جنبا إلى جنب مع هذا البروتوكول تعداء جذابة وقد تمهد الطريق للعديد من الباحثين في المجتمع ديكتيوستيليوم . ومع ذلك، ينبغي أن تدرس قابلية نظام التعبير عابر المنشأة المستخدمة كريسبر/Cas9 في أكسينيك الخلايا المزروعة بعناية.
يوفر act5 تدق في نظام عرض نظام تكامل آمنة وموثوق بها لتوليد خطوط الخلايا مستقرة في ديسكويديوم دال، مع استفادة مواقع مماثلة في سائر الكائنات الحية22. كما يعتمد على حدث واحد تكامل في الجينوم ويوفر العديد من الإمكانيات للاتجاهات البحثية المختلفة. مروج act5 تنشط بقوة وضمانات التعبير متجانسة تقريبا27 مستقلة عن شروط زراعة. البروتينات الفلورية مراسل يمكن دمجها بسهولة في هذا المكان ملاذا والبلازميدات استهداف هندسيا باستخدام. يمكن أن يكون هذا مفيداً، على سبيل المثال، لأغراض تتبع الخلية، كما هو موضح هنا في تجربة مزيج. إظهار الخلايا تقلب أدنى خلية إلى التعبير، التي يمكن أن تساعد في الخلية الآلي تتبع. الأهم من ذلك، يظهر إدخال تسلسل المطلوب في موضع العمل5 محايدة فينوتيبيكالي28،29. حسبما التعبير لا تعتمد على علامة اختيار للحفاظ على التعبير البروتين، كما رأينا في إينتيجرانتس عشوائي أو خطوط الخلايا الحاملة لناقل اكستراتشروموسومال، نظام act5 يمكن أن تكون مفيدة لتجارب الإنقاذ، كذلك. منذ خطوط الخلية متجانسة، يمكن تحليل كافة الخلايا. وهذا لا يمكن استخدام بلازميد اكستراتشروموسومال للتعبير، التي يوجد تباين كبير في التعبير.
وبالإضافة إلى هذه التحسينات العامة لجميع سلالات، يتيح القدرة على استخدام غير أكسينيك البرية من نوع الخلايا للأبحاث الجزيئية تقييما لآثار الطفرات المتراكمة في سلالات المختبر الحالي. تم العثور على عدة ترتيبات جديدة الوراثية منذ اعتماد سلالة Ax2 في عام 1970، كما يتضح من تحليلات ميكرواري المنشورة سابقا26. ولوحظت تعمل الاصطناعية بسبب وجود هذه الطفرات. على سبيل المثال، يظهر متحولة المبلغ هو2 التصاق انخفض في مختبر واحد سلالة الخلفية والالتصاق المتزايد في آخر3. مثل هذه البيانات المتضاربة يمكن حلها الآن بتكرار هذه التجربة في سلالة الجد المشترك (في هذه الحالة، DdB). وقد تبين قوة هذا النهج مؤخرا لل30،جتباسي رأس الصغيرة31.
القدرة على إجراء التجارب الجينية في أي سلالة ديسكويديوم دال- يوسع إمكانيات البحث الاتجاهات الجديدة التي تعتمد على استخدام يعزل البرية، لا سيما تلك التي تنطوي على التطور الاجتماعي والتعرف على الأقرباء و دورة الجنسي22.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون مختبر كاي للإدخال لهذا الأسلوب و LMB المجهري والتدفق الخلوي مرافق للدعم العلمي والتقني الممتاز. تم تمويل هذا العمل من “مجلس البحوث الطبية في” منحة MC_U105115237 ر. ر. كاي، بسرك (مجلس بحوث العلوم البيولوجية والتكنولوجيا الأحيائية) منحة BB/K009699/1 إلى ر. ر. كاي، منح “أبحاث السرطان” في بريطانيا A15672 R. H. Insall، “ويلكوم ترست كبار زمالة” 202867/Z/16/Z لجوناثان R تشب، ولجنة نهر الميكونج التمويل (MC_U12266B) إلى “وحدة جامعة لمكب لجنة نهر الميكونج” في دوري إبطال أوروبا.
Materials
| Equipment | |||
| Eppendorf Microcentrifuges 5424/5424R | ThermoScientific | 05-400-002 | |
| Eppendorf 5702R Centrifuges with A-4-38 Model Rotor | ThermoScientific | 12823252 | |
| Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal Cyclers | Sigma Aldrich | EP6331000025 | |
| Gene Pulser X Cell, including CE & PC modules | BioRad | 1652660 | |
| Safety Cabinet Foruna – SCANLAF | Labogene | ||
| BioPhotometer Plus | Eppendorf | ||
| CLSM 710 | Zeiss | ||
| Media & Agaroses | |||
| LoFlo Medium | Formedium | LF0501 | |
| Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | |
| Low EEO Agarose | BioGene | 300-200 | |
| Purified Agar | Oxoid | LP0028 | |
| SM broth | Formedium | SMB0102 | |
| 2x LB broth | Formedium | LBD0102 | |
| Chemicals | |||
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoScientific | S33102 | |
| 1 Kb Plus DNA Ladder | ThermoScientific | 10787018 | |
| 1 Kb DNA Ladder | NEB | N3232L | |
| HEPES free acid | Sigma Aldrich/Merck | 391340 EMD | |
| KH2PO4 | VWR | P/4800/53 | |
| Na2HPO4 * 2 H2O | VWR | 10028-24-7 | |
| MgCl2 * 6 H2O | Sigma Aldrich/Merck | 5982 EMD | |
| CaCl2 * 2 H2O | Sigma Aldrich | 442909 | |
| Folic Acid | Sigma Aldrich | F7876 | |
| KOH | VWR | 26668.263 | |
| Cultur Dishes | |||
| 96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Low Evaporation Lid, Tissue Culture Treated | Corning Incorporated | 3595 | |
| 6 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid, Tissue Culture Treated | Corning Incorporated | 3516 | |
| 100 x 20 mm style Tissue Culture Dish, Tissue Culture Treated | Corning Incorporated | 353003 | |
| 50 mm Glass Bottom Microwell Dishes No1.5 | MatTek Corporation | P50G-1.5-30-F | |
| Antibiotics | |||
| Geneticin G418-sulphate | Gibco by Life Technologies | 11811-023 | |
| Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | |
| Additional Consumables | |||
| 2mm gap electroporation cuvettes, long electrode | Geneflow Limited | E6-0062 | |
| 10 µl Inoculating Loop, Blue 10 Micro L | ThermoScientific | 129399 | |
| Spreader, L-shaped, sterile | greiner bio-one | 730190 | |
| Combitips advanced 5 ml | Eppendorf BIOPUR | 30089669 | |
| Kits | |||
| ZR Plasmid Miniprep Classic | Zymoresearch | D4016 | |
| Quick DNA Miniprep Kit | Zymoresearch | D3025 | |
| Zymoclean DNA Recovery Kit | Zymoresearch | D40002 | |
| Enzymes | |||
| Restriction enzymes | NEB | ||
| OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | NEB | M0482L | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| PrimeSTAR Max DNA Polymerase | TakaraBio | R045A |
Riferimenti
- Schaap, P. Evolutionary crossroads in developmental biology: Dictyostelium discoideum. Development. 138 (3), 387-396 (2011).
- Sussman, R., Sussman, M. Cultivation of Dictyostelium discoideum in axenic culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 29, 53-55 (1967).
- Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum. Genome Biology. 9 (4), 75 (2008).
- Witke, W., Nellen, W., Noegel, A. Homologous recombination in the Dictyostelium alpha-actinin gene leads to an altered mRNA and lack of the protein. The EMBO Journal. 6, 4143-4148 (1987).
- De Lozanne, A., Spudich, J. A. Disruption of the Dictyostelium myosin heavy chain gene by homologous recombination. Science. 236, 1086-1091 (1987).
- Howard, P. K., Ahern, K. G., Firtel, R. A. Establishment of a transient expression system for Dictyostelium discoideum. Nucleic Acids Research. 16, 2613-2623 (1988).
- Knecht, D., Pang, K. M. Electroporation of Dictyostelium discoideum. Methods in Molecular Biology. 47, 321-330 (1995).
- Wetterauer, B., et al. Wild-type strains of Dictyostelium discoideum can be transformed using a novel selection cassette driven by the promoter of the ribosomal V18 gene. Plasmid. 36, 169-181 (1996).
- Lloyd, M. M., Ceccarelli, A., Williams, J. G. Establishment of conditions for the transformation of nonaxenic Dictyostelium strains. Developmental Genetics. 11, 391-395 (1990).
- Bloomfield, G., et al. Neurofibromin controls macropinocytosis and phagocytosis in Dictyostelium. eLife. 4, (2015).
- Veltman, D. M., et al. A plasma membrane template for macropinocytic cups. eLife. 5, (2016).
- Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. PIP(3)-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis. The Journal of Cell Biology. 204 (4), 497-505 (2014).
- Hoeller, O., Kay, R. R. Chemotaxis in the absence of PIP3 gradients. Current Biology. 17, 813-817 (2007).
- Chubb, J. R., Wilkins, A., Thomas, G. M., Insall, R. H. The Dictyostelium RasS protein is required for macropinocytosis, phagocytosis and the control of cell movement. Journal of Cell Science. 113, 709-719 (2000).
- Schaap, P., et al. Molecular phylogeny and evolution of morphology in the social amoebas. Science. 314, 661-663 (2006).
- Du, Q., Kawabe, Y., Schilde, C., Chen, Z. H., Schaap, P. The Evolution of Aggregative Multicellularity and Cell-Cell Communication in the Dictyostelia. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3722-3733 (2015).
- Hirose, S., Benabentos, R., Ho, H. I., Kuspa, A., Shaulsky, G. Self-recognition in social amoebae is mediated by allelic pairs of tiger genes. Science. 333 (6041), 467-470 (2011).
- Strassmann, J. E., Queller, D. C. Evolution of cooperation and control of cheating in a social microbe. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (2), 10855-10862 (2011).
- Wolf, J. B., et al. Fitness Trade-offs Result in the Illusion of Social Success. Current Biology. 25 (8), 1086-1090 (2015).
- Veltman, D. M., Akar, G., Bosgraaf, L., Van Haastert, P. J. A new set of small, extrachromosomal expression vectors for Dictyostelium discoideum. Plasmid. 61 (2), 110-118 (2009).
- Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. Journal of Molecular Biology. 98 (3), 503-517 (1975).
- Paschke, P., et al. Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum. PLoS One. 13 (5), 0196809 (2018).
- Woznica, D., Knecht, D. A. Under-agarose chemotaxis of Dictyostelium discoideum. Methods in Molecular Biology. 346, 311-325 (2006).
- Dubin, M., Nellen, W. A versatile set of tagged expression vectors to monitor protein localisation and function in Dictyostelium. Gene. 465 (1-2), 1-8 (2010).
- de Hostos, E. L., et al. Dictyostelium mutants lacking the cytoskeletal protein coronin are defective in cytokinesis and cell motility. Journal of Cell Biology. 120, 163-173 (1993).
- Sekine, R., Kawata, T., Muramoto, T. CRISPR/Cas9 mediated targeting of multiple genes in Dictyostelium. Scientific Reports. 8 (1), 8471 (2018).
- Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
- Rosengarten, R. D., et al. Leaps and lulls in the developmental transcriptome of Dictyostelium discoideum. BMC Genomics. 16, 294 (2015).
- Tunnacliffe, E., Corrigan, A. M., Chubb, J. R. Promoter-mediated diversification of transcriptional bursting dynamics following gene duplication. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (33), 8364-8369 (2018).
- Gebbie, L., et al. Phg2, a kinase involved in adhesion and focal site modeling in Dictyostelium. Molecular Biology of the Cell. 15, 3915-3925 (2004).
- Jeon, T. J., Lee, D. J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II. Journal of Cell Biology. 176, 1021-1033 (2007).
