Kvantitativ undersøkelse av antibiotika mottakelighet av Neisseria gonorrhoeae aggregater bruker ATP-utnyttelse kommersielle analyser og Live/Dead flekker
Summary
En enkel ATP-måling analysen og live/døde flekker metoden ble brukt for å kvantifisere og visualisere Neisseria gonorrhoeae overlevelse etter behandling med ceftriaxone. Denne protokollen kan utvides for å undersøke de antimikrobielle effektene av noen antibiotika, og kan brukes til å definere den minimale inhibitoriske konsentrasjonen av antibiotika i bakteriell biofilm.
Abstract
Fremveksten av antibiotika resistente Neisseria gonorrhoeae (GC) er en verdensomspennende helserisiko og understreker behovet for å identifisere personer som ikke behandling. Denne Gram-negative bakterie forårsaker gonoré utelukkende hos mennesker. Under infeksjon er det kjøpedyktig skjemaet aggregater og/eller biofilm. Minimum inhibitoriske konsentrasjon (MIC) testen brukes for å bestemme mottakelighet for antibiotika og definere riktig behandling. Men mekanismen for utryddelsen i vivo og dens forhold til laboratorium resultatene er ikke kjent. En metode som undersøker hvordan GC aggregering påvirker antibiotika mottakelighet og viser forholdet mellom samlede størrelsen og antibiotika mottakelighet ble utviklet. Når GC samlet, de er mer motstandsdyktig mot antibiotika drapet, gjenlevende med bakterier i midten ceftriaxone behandling bedre enn i periferien. Dataene viser at N. gonorrhoeae aggregering kan redusere sin mottakelighet for ceftriaxone, noe som ikke gjenspeiles bruke standard agar plate-baserte MIC metoder. Metoden som brukes i denne studien vil tillate forskere å teste bakteriell mottakelighet under klinisk relevante forhold.
Introduction
Gonoré er en felles seksuelt overførbare infeksjoner (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), en Gram-negative diplococcal bakterie, er den utløsende agenten for denne sykdommen. Symptomer på genital infeksjon kan føre smerte under vannlating, generalisert genital smerte og urethral utslipp. Infeksjonen er ofte asymptomatisk2,3,4,5, og dette gir utvidet kolonisering. Disse ubehandlet infeksjoner er en stor helse bekymring, som de har potensial til å lette overføringen av organismen, og dette kan føre til komplikasjoner som bekken inflammatorisk sykdom (PID) og spres gonococcal infeksjon (DGI)6. Antibiotika-resistente gonoré er en stor offentlig helse-krise og en økende sosioøkonomiske byrden7. Mindre mottakelighet for cefalosporiner har ført til behandling diett endring fra en enkelt antibiotika til dobbel terapi, som kombinerer azithromycin eller doxycycline med ceftriaxone8. Økt svikt av ceftriaxone og azithromycin9,10, i kombinasjon med asymptomatisk infeksjoner, fremhever behovet for å forstå gonoré behandling feil.
Minimum inhibitoriske konsentrasjon (MIC) test, herunder agar fortynning og platen diffusjon tester, har vært brukt som standard medisinsk testen for å identifisere motstand mot et antibiotikum. Likevel er det uklart om MIC testen gjenspeiler bakteriell antibiotikaresistens i vivo. Dannelsen av bakteriell biofilm bidrar til overlevelse av bakterier i nærvær av bakteriedrepende konsentrasjoner av antibiotika: MIC testing er finner denne effekten11. Fordi GC kan danner biofilm på slimhinnene overflater12, vi hypothesize at antibiotika mottakelighet innen aggregater ville være forskjellig fra det sett i enkelte GC. I tillegg har studier vist at trefase variabel overflaten molekyler, Pili, tetthet-assosiert protein (Opa), og lipooligosaccharides (LOS), som regulerer mellom bakterie interaksjoner, føre til ulike størrelser aggregater13, 14 , 15. bidrag av disse komponentene til antibiotikaresistens har ikke blitt undersøkt skyldes mangel på skikkelig metoder.
For tiden finnes det flere metoder å måle biofilm utrydding. Den mest brukte kvantitative metoden er ved å måle endringer i biomasse bruker crystal violet flekker16. Metoden krever imidlertid betydelig eksperimentelle manipulasjon, som kan potensielt generere feil i forsøket gjentas17. Live/døde flekker metoden brukt her lar visualisering av levende og døde bakterier og distribusjonen innen biofilm. Biofilm strukturen kan imidlertid utgjøre en fysisk barriere som reduserer fargestoff penetrasjon. Derfor for å kvantifisere live/døde bakterier i en gruppe, er den flekker begrenset til små biofilm eller forløper-microcolonies eller samlinger. Andre metoder, inkludert agar fortynning og platen diffusjon testene, kan ikke måle effekten av aggregering. Undersøke GC mottakelighet i aggregering etter antibiotika eksponering, en ideell metode ville nød for å ha begge en kvantitativ analyse som kan måle bor bakterier og visualisere distribusjonen.
Fremgangsmåten som er beskrevet her kombinerer en ATP-utnyttelse måler og en live/døde flekker analysen til kvantitativt og visuelt undersøke GC mottakelighet innen aggregater i nærvær av antibiotika.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bakterier kan danne biofilm under infeksjon av menneskekroppen. Tradisjonelle mikrofon test gjenspeiler ikke konsentrasjonen trengs å utrydde bakterier i en biofilm. For å teste poesi aksent effekter på en biofilm, kan metoder basert på biofilm biomasse samt plating CFUs være feil på grunn av virkningen av biofilm struktur. For eksempel fungerer metoden plating bare hvis biofilm kan bli avbrutt. Derfor være CFU fått lavere enn det faktiske antallet levedyktig bakterier. Visualisere slaktede og levende bakterier i…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Institute of Health D.C.S. og WS AI123340. L.-CW, JW, AC, og E.N. ble støttet i del/delta i “The første års innovasjon & forskning Experience” program finansiert av University of Maryland. Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet. Vi erkjenner UMD CBMG Imaging kjernen for alle mikroskopi eksperimenter.
Materials
| 100x Kellogg's supplement | |||
| Agar | United States Biological | A0930 | |
| BacTiter Assay | Promega | G8232 | |
| Ceftriaxone | TCI | C2226 | |
| Difco GC medium base | BD | 228950 | |
| Ferric nitrate, nonahydrate | Sigma-Aldrich | 254223-10G | |
| Glucose | Thermo Fisher Scientific | BP350-1 | |
| L-glutamine Crystalline Powder | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| BacLight live/dead staining | Invitrogen | L7012 | |
| MS11 Neisseria gonorrhoeae strain | kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Proteose Peptone | BD Biosciences | 211693 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-10 | |
| Soluble Starch | Sigma-Aldrich | S9765 | |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754-5G | |
| Equipment | |||
| Petri Dishes | VWR | 25384-302 | |
| 8-well coverslip-bottom chamber | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| 96-well tissue culture plates | Corning, Falcon | 3370 | |
| Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) | Nuaire | 32776 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | Model 3530 | |
| Confocal microscope equipped with live imaging chamber | Leica | SP5X | |
| Corning 96 Well Black Polystyrene Microplate | Corning | 3904 | |
| Glomax Illuminator | Promega | E6521 | |
| Pipette tips (0.1-10 µL) | Thermo Fisher Scientific | 02-717-133 | |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-382 | |
| Pipette tips (200 µL) | VWR | 53509-007 | |
| Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV | Pharmacia Biotech | 80-2106-00 | |
| Sterile 15 ml conical tubes | VWR | 21008-216 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) | Sorenson BioScience | 16070 | |
| Sterile polyester-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Sonicator | Kontes | Equivelent to 9110001 |
Riferimenti
- den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study. BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).
- Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents. The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).
- Hananta, I. P., et al. Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia. Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).
- Chlamydia, W. H. O. Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections. World Health Organisation. , (2011).
- Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. Diagnosis and management of gonococcal infections. American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).
- Alirol, E., et al. Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines. PLOS Medicine. 14 (7), (2017).
- Workowski, K. A., Bolan, G. A. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015. MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).
- Lahra, M. M., et al. Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).
- Wi, T., et al. Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action. PLOS Medicine. 14 (7), 1002344 (2017).
- Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents. Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).
- Greiner, L. L., et al. Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).
- Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
- Stein, D. C., et al. Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells. PLoS One. 10 (8), 0134342 (2015).
- LeVan, A., et al. Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O’Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. , (2005).
- Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
- White, L. A., Kellogg, D. S. Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method. Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).
- Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns. Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).
- Herten, M., et al. Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces. Frontiers in Microbiology. 8, 2333 (2017).
- Gracia, E., et al. In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification. Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).
- Webb, J. S., et al. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).
- Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. Journal of visualized experiments. (47), (2011).
- Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility. Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).
- Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).
- Hall-Stoodley, L., et al. Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).
