Floresans ile kurulan Purified Gabaerojik veya glutamaterjik nöronların primer hücre kültürü-aktif hücre sıralama

Tüm prosedürler ve hayvan bakımı kurumsal yönergelere uygun olarak, Alman hayvan refahı Yasası ve Avrupa Konseyi Direktifi 86/609/EEC hayvanların korunması ile ilgili olarak, yerel izinlerin varlığında gerçekleştirildi makamları (LaGeSo Berlin, T-0215/11). Not: Bu protokol tek bir transjenik fare veya sıçan PUP (postnatal gün 0 – 2) tarafından saflaştırılmış nöronların kültürünü açıklar. Tüm teknikler steril koşullarda yapılmalıdır. Tüm çözümler 0,2 μm filtre kullanılarak sterilize edilmelidir (bkz. malzeme tablosu). Cam kapak ve diseksiyon aletleri ısı sterilize olmalıdır 3 saat 185 °C. 1. poli-L-lizin ile kaplama cam Coverfları 200 μg/ml Poly-L-lizin (PLL) çözeltisi 5 ml kısım buz çözme ile cam Cover, hazırlayın. 45 mL saf enjeksiyon suyu ekleyerek bu stok çözümünü 20 μg/mL ‘ye seyreltin. Filtre-solüsyonu yeni 50 mL konik tüpüne sterilize edin. Bu tüpü “PLL steril” olarak etiketleyin.Not: Buzlanma sürecini hızlandırmak için oda sıcaklığında saklanan suyu kullanın. Steril PLL çözeltisi için 100 Steril, yuvarlak, 12 mm cam kapak ekleyin. Tüpü her 5 – 10 dakikada, 2 – 3 dakika boyunca, hatta kaplama sağlamak için karıştırın. Ceket 1 h için bu şekilde Cover,.Not: Almanya ‘da üretilmiş yuvarlak cam coverları (çap = 12 mm), güvenilir bir kültür yüzeyi sağlarsa ve 24-kuyu hücresi kültürü plakasının kuyularına kolayca sığması gibi tercih edilir. PLL kaplama 40 dk sonra, doku kağıt 2 adet almak ve onları akış kabine düz yatıyordu. 70% etanol kullanarak kağıt sterilize, sonra kırışıklıkları kaldırmak ve kuru bırakmak için Düzleştir. PLL ile 1 h için cam Cover, kaplama sonra, aşırı PLL çözeltisi kaldırmak ve steril enjeksiyon sınıfı su ekleyin. Aşırı PLL ‘nin kaldırılmasına izin vermek için coverfaları 2 – 3 s için yavaşça karıştırın. Bu durulama adımını 2 ek kez tekrarlayın. Fazla suyu çıkarın ve ardından coverları steril kağıt dokusuna aktarın. Kavisli forseps kullanarak her lamel magazini dikkatle ayırın ve kurumaya bırakın.Not: Kolayca ayrı olmayan coverfiş atılabilir. Alternatif olarak, ayrılmaya yardımcı olmak için küçük bir miktar su eklenebilir. Kuru bir kez, 24-Well kültür plaka için Cover, transfer.Not: Kaplama işlemleri, diseksiyon işlemine başlamadan önce yaklaşık 30 dk – 1 saat hazır yapılmalıdır. Plakalar 37 °C ve% 5 CO2 ‘ de bir kuluçta saklanabilir. 2. hipokampal ve Kortikel dokusunun dağılma Hücre kültürü çözümlerinin hazırlanması Nöral dokunun dağılabilmesi için, ilk olarak 40 mL ‘Lik bir hücre kültürü arabelleğini defrost (kompozisyon [mM]: 116 NaCl, 5,4 KCl, 26 NaHCO3, 1,3 Nah2Po4, 1 MgSO4· 7h2o, 1 CACL2· 2H2o, 0,5 EDTA · 2Na · 2H2O ve 25 D-glikoz, pH = 7,4). 12 mL hücre kültürü arabelleğini 15 mL konik tüpten ölçün; “BSA” olarak etiketleyin. 5 mL hücre kültürü arabelleğini farklı bir 15 mL tüpüne ölçün; “papain” olarak etiketleyin. 37 °C ‘ de 15 dakika boyunca su banyosunda her iki tüpü de kulküat. Filtre-kalan hücre kültürü tamponunu, etiketi “tampon-steril” olarak sterilize edin ve gerekli olana kadar 4 °C ‘ de saklayın. Ağırlığı 120 mg Sığır serum albumin (BSA) ve “BSA” etiketli tüp ekleyin. 7 mg papain dışarı tartım ve “papain” etiketli tüp ekleyin. İki tüpü 15 dakika boyunca su banyosuna geri dönün.Not: Papain tozu transferini kolaylaştırmak için tartım teknesine küçük bir miktar tampon eklemek yararlıdır. Tüm tozlar çözündüğünde, her bir solüsyonu taze 15 mL konik boruya filtreleyin. Tüp papain için, filtrelenmiş çözümü “papain-steril” olarak etiketleyin. Tüp BSA için, her biri 4 mL BSA çözeltisi içeren steril BSA çözümünü 3 tüplere bölün. Her tüpü “BSA-steril” ve “1”, “2” veya “3” olarak etiketleyin. Tüm tüpleri su banyosuna geri dönün ve gerektiğinde 37 °C ‘ de inküymeye devam edin. Doku diseksiyonu için hazırlık 35 mm filtre kağıdı tek bir parça alın ( malzeme tablosunabakın) ve% 70 etanol ile sterilize; 100 mm Petri tabağı kapağında, bir akış kabininde kurumaya bırakın. Hippocampus ve korteks diseksiyonu için gerekli makas, forseps, neşter ve spatula ( malzeme tablosunabakın) koymak. Yer 2 35 mm Petri yemekleri ve akış kabine merkezinde erişilebilir bir konumda steril filtre kağıdı içeren bir 100 mm Petri çanak. Transjenik NexCre toplamak; AI9 ve VGAT Venüs Fare yavruları dissected olmaktır. Vahşi tip Littermates gelen floresan pups ayrımcılık için uygun uyarılma ve emisyon filtreleri ( malzeme tablosunabakın) ile bir floresan lamba kullanın. Hayvanları kesmeden hemen önce, her 35 mm Petri tabağı ile soğutulmuş, steril hücre kültürü arabelleği doldurun.Not: Bir petri çanak disiksiyonlar arasındaki araçları temizlemek için, ve diğer hipokampus ve korteks toplamak için. Doku diseksiyonu En kısa sürede hücre kültürü tampon döküldü, bir postnatal gün 0 – 2 transjenik fare veya sıçan yavru büyük, keskin makas kullanarak ve sterilizasyon 100 mm Petri tabak akış kabine içine başını aktarmak için kullanın. Dikkatli bir transgenik yavru beyin steril filtre kağıt aktarmak için forseps, makas ve bir spatula kullanın. Bir tip 22 neşter kullanın ve serebellum uzakta ayırmak için 2 Yarımküre ayırın. Lateral hemheres rulo küçük bir spatula kullanın. Her Yarımküre üzerinde, yavaşça böylece korteks filtre kağıdı ile temas içine gelir basın. Nazikçe Hippocampus ve korteks ortaya çıkarmak için orta beyin bölgeleri taşıyın.Not: Hemheres veya hücreler üzerinde bastırırken çok fazla basınç uygulamak için dikkatli olun ezilmiş hale gelebilir. Hippocampus ve korteks her Yarımküre ayırmak için bir neşter veya spatula kullanın. Disseke dokuyu, soğutulmuş hücre kültürü arabelleği içeren 35 mm Petri tabağına aktarın.Not: Birden fazla hayvanı kesiyorsanız, 50 mL konik tüpte steril hücre kültürü arabelleğini buzda saklayın. Her diseksiyondan sonra, disseke dokusu soğutulmuş hücre kültürü arabelleğine aktarın. Cortico-hipokampal dokusunun başarılı diseksiyondan sonra, steril papain solüsyonu su banyosundan akış kabinesine aktarın. Disseke hipokampus ve korteks steril 35 mm Petri tabağı kapağına aktarmak için 3 ml Pasteur pipet kullanın. Bir Criss-Cross hareket Chop, bir tip 22 neşter düz kısmını kullanarak, doku küçük parçalara kadar. Petri çanağının kapağındaki doğranmış dokusu steril papain tüpüne aktarmak için küçük bir miktar papain çözeltisi kullanın. Papain tüpünü su banyosuna geri dönün ve 37 °C ‘ de 25 dak. Papain kuluçkan sırasında, tam floresan medya çözümü makyaj. Defrost bir 1 ml kısım B27, bir 0,5 ml kısım glutamax ve bir 0,5 ml kısım pen-strep. Aliquot 48,5 mL hazırda bekletme 50 mL konik tüpüne düşük floresan medya. Çözüme B27, Glutamax ve pen-strep ekleyin. İyi, sonra filtre sterilize ve etiket “hibernate A tam medya” (Tarih ve baş harfleri ile) çözüm Shake. 37 °C ‘ de su banyosuna inküye yapın. Papain kuluçarı sonrası, papain-tüp ve steril BSA-tüpleri akış kabinine aktarın. Papain tüpünden sadece korico-hipokampal dokusunu BSA-tüp 1 ‘ e çıkarmak için 1 mL Pasteur pipet kullanın.Not: Aşırı papain çözeltisi transferini en aza indirmek için özen yapın. Hücrelerin dissociation Herhangi bir büyük doku kümesini kırmak için 1 mL Pasteur pipet kullanarak dokuyu birkaç kez triturate. Bunun ardından, güzel bir bahşiş Pasteur pipet kullanarak doku 7 kez triturate. 30 sn için doku bırakın, daha büyük doku parçaları sediment izin. 30 s sonra, 1 mL solüsyonu ve dokusunu BSA-Tube 1 ‘ den BSA-Tube 2 ‘ ye aktarın. Güzel bir bahşiş Pasteur pipet kullanarak BSA-Tube 2 ‘ deki dokuyu birkaç kez triturate. Tritürasyon sonrası, BSA-Tube 1 ‘ den daha düşük 1 mL doku ve solüsyonu tekrar aktarın, ancak şimdi BSA-Tube 3 ‘ e gidin. Güzel bir bahşiş Pasteur pipet kullanarak BSA-Tube 3 ‘ te dokuyu birkaç kez triturate. Triturasyon sonrası, 2 ve 3 numaralı tüplerden tüm solüsyonu ve dokusu BSA-tüp 1 ‘ ye aktarın. Daha fazla 2-3 kez triturate ve 3 dakika için 3.000 x g Santrifüjü. Santrifüjleme sırasında, tam neural bazal bir medya (NBA medya) makyaj. Aliquot 48,5 mL bir 50 mL konik tüp için NBA medya ve bir su banyosunda 37 °C ‘ de inküat. Etiket bu tüp “sadece NBA”. Ayrıca, bir 1 ml kısım B27, glutamax bir 0,5 ml kısım ve oda sıcaklığında pen-strep bir 0,5 ml kısım defrost. Santrifüjleme sonrasında, süpernatant ‘ı pelletli dokudan dikkatle çıkarın ve 2 ml ‘lik tam medya içinde hücreleri yeniden askıya alın. Dokusunu 20 kez yukarı ve aşağı triturate için bir P1000 pipet kullanın.Not: Hücreleri çok güçlü bir şekilde pipet etmeye dikkat et. Çok fazla basınç uygulandığında, hücreler zarar görebilir. Hücre süspansiyonunu bir polistiren numune tüpüne 30 μm hücreli elek aracılığıyla filtrelemek için 1 mL Pasteur pipet kullanın.Not: Hücre süspansiyon hemen hücre elek üzerinden geçmiyorsa, akış başlatmak için steril bir eldiven ile elek üstüne basın gerekli olabilir. Bu önemli adım , hücre sıralayıcısı tıkanmasını önler. Sıralamadan sonra nöronlar toplamak için, gerekli sayıda Polipropilen tüpün tam medya 300 μL pipetleme ile toplama tüpleri hazırlayın. Hücre süspansiyonu şimdi sıralama için hücre sıralayıcısı alınacak hazırdır. Hücre süspansiyonu alın, ekstra toplama tüpleri ve yedek parça komple medya numunenin seyreltme gereklidir. 3. hücre sıralama Purified GABAergic veya Glutamatergic neurons Not: Sıralama sırasında bakteriyel kontaminasyon olasılığını en aza indirmek için, Sıralayıcı numune tüpünü, sıralama işleminden en az 5 dakika önce 70% etanol ile durulayın. Ayrıntılı sıralama parametreleri araçlar arasında farklılık gösterir, temel hususlar aşağıdaki gibidir. İlk hücre sıralaması sırasında, vahşi bir tür hayvandan hücreleri sıralayarak ve karşılaştırarak etiketlenmemiş hücrelerden arka plan floresans düzeylerini oluşturun. Her floresan hücre türünün sıralanması için uygun uyarılma ve emisyon filtrelerini seçin. Sırasıyla 488 nm veya 531 nm uyarma dalga boyları kullanarak Venüs ve TdTomato proteinlerini Excite. Sırasıyla 530/40 ve 575/30 emisyon filtre setleri aracılığıyla yayılan ışığı algılayın. Hücre toplama için hücre sıralayıcısı, tam medya 300 μL içeren Polipropilen toplama tüpleri ekleyin. Yüksek saflıkta, parlak etiketli floresan hücreleri sıralayın (bkz. Şekil 1B örneğin sıralanmış hücrelerin nokta grafikleri). En iyi sonuçlar için sıralamayı takiben, saflık düzeylerini tahmin etmek için sıralanmış hücrelerin bir saflık testi gerçekleştirin. Sıralamayı izleyen hücrelerin tipik kurtarma oranının% 70-80 arasında olduğunu unutmayın. Her koleksiyon tüpünde sıralanmış hücre sayısını not edin. Bu değer, hücre sıralama aleti tarafından verilir.Not: Hücre sıralama 70 μm nozul (70 psi kılıf sıvı basıncı) veya 100 μm nozul (20 psi kılıf sıvı basıncı) kullanılarak gerçekleştirilebilir. 4. sıralanmış nöronların kültürü Hücre sıralamanın ardından, 1 mL Pasteur pipet kullanarak toplanan hücreleri 2 mL yuvarlak alt santrifüjlere aktarın. Hücre Pelet oluşturmak için 3 dakika 3.000 x g ‘de hücreleri santrifüjler.Not: Hücre Pelet konumunu belirlemeye yardımcı olmak için, yuvarlak alt santrifüjli tüpler dışa dönük kapak menteşe ile oryantasyon, hangi hücre Pelet Santrifüjü tüp arkasında formu sağlar (yani, menteşe olarak tüp aynı tarafında). Santrifüjleme sırasında, 1 mL B27, 0,5 mL Glutamax ve 0,5 mL pen-strep ‘ i k i ön ısıtılmış NBA medyasını 48,5 mL ‘ye ekleyin. İyi, sonra filtre sterilize ve etiket “NBA komple medya” (Tarih ve baş harfleri ile) çözüm sallayın. Gerekli olana kadar su banyosuna dönün. Santrifüjleme sonrasında, süpernatant ‘ı farklı bir santrifüj tüpüne aktarmak için 1 ml Pasteur pipet kullanın (hücre peleti rahatsız edildi süpernatant örtmek korumak). Hücre/μL 1.000 hücre yoğunluğunu elde etmek için ön-ısıtılmış komple NBA medya gerekli miktarda cep Pelet yeniden askıya. P200 veya P1000 pipet ile yukarı ve aşağı pipetleme ile hücreleri yeniden askıya alın. Ayrılmış hücrelerin varlığını onaylamak için, 4X veya 10X objektif bir objektif kullanarak, mikroskop altında hücre çözümünü kontrol edin. Alternatif olarak, küçük bir miktar hücre çözümünü bir lamel magazini üzerine pipet ve mikroskop altında kontrol edin. Çok sayıda hücre varsa, adım 4,3 süpernatant atılabilir. Hücreleri kaplamadan önce, 2-3 s için orta hızda Vortex, hatta hücre süspansiyonu sağlamak için. En kısa sürede, hızlı bir şekilde 10 μL hücre süspansiyon her coverslip merkezine pipet. Hücreleri pipetleme yaptıktan sonra, her plakayı hızlı bir şekilde kuluçağa (5% CO2/37 °c) dönün ve 1 saat boyunca inkübe edin.Not: Birden fazla 24-kuyu plakaları için hücre ekleme, plakalar arasında hücreler vortekslenir tarafından bile hücre yoğunlukları emin olun. 1 saat sonra, 500 ile hücreleri beslemek ön-ısıtılmış komple NBA medya μL ve kuluçk dönün.Not: Hücreleri beslerken, hücre dekolmanı önlemek için medyayı yavaşça kuyu tarafına pipet etmek önemlidir. Kısa deneyler için (< 16 gün), yukarıdaki yoğunlukta beslenme gerekli değildir. Hücrelerin daha fazla yoğunluğunu kaplamasını yaparken, daha sık beslenme aralıkları gerekebilir ( tartışmakonusuna bakın). 5. astrocyte zenginleştirilmiş glial destek kültürler Not: Glial kültürler14 üretimi ve hücre kültürü ekler kullanımı daha önce açıklanan12. Kısacası, astrosit zenginleştirilmiş glia kültürler cortico-hipokampal dokudan türetilir (meningler kaldırıldı; P2-P5), bir hafta boyunca bir 20 μg/mL PLL-kaplamalı 6-kuyu plakaları, serum tamamlayıcı DMEM medya üzerinde kültürlü olmuştur. Co-Culture saflaştırılmış nöronlar ve glial hücreler için, geçiş confluent glial hücreler hücre kültürü ekler gerekli sayıda (0,4 μm gözenek boyutu- malzeme tablosunabakın). Hücreler arasında geçiş yapmak için, 2 mL ön ısıtılmış (37 °C) fosfat tamponlu tuz (PBS) ile 2 kuyu, iki kez, kuluçağından confluent glial hücreleri içeren 6 kuyu plakasını çıkarın. PBS çözümünü aspirate ve 1 mL ön ısıtılmış (37 °C) tripsin (1:250)/EDTA (% 0,25/0.02%) eklemek için bir P1000 pipet kullanın Her kuyu için çözüm. 6-kuyu plakasını kuluçağa dönün ve hücre dekolmanı için her 2 – 3 dakikada bir kontrol edin. Önemli bir hücre dekolmanı oluştuğunda, hücreler ve hücre çözümünü hafifçe yukarı ve aşağı ince bir ipucu Pasteur pipet kullanarak pipet, daha fazla ayrışma ve bireysel hücrelerin ayrılması yardımcı olmak için. Hücre çözümünü 15 mL Konik Tüpe aktarın ve 3.000 x g ‘de santrifüjle 3 dakika boyunca santrifüj yapın. Hücre peleti çözelti kadar yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme tarafından ön ısıtılmış (37 °C) NBA komple medya 5 mL bir P1000 pipet kullanarak hücreleri yeniden askıya. Bir hemokytometer veya otomatik hücre sayacı kullanarak bir hücre sayısı gerçekleştirin.Not: Kültür 7 gün sonra, yaklaşık 750000-1000000 hücreler her iyi bir 6-kuyu plaka hasat edilebilir. Plaka 40.000 glial hücreler her hücre kültürü için bir 500 μL damlacık (80 hücreler/μL) ekleyin. Hücrelerin 1 h için uygun izin verdikten sonra, 24-kuyu plakaları saflaştırılmış nöronlar içeren glial kaplı hücre kültürü ekler aktarmak için steril forseps kullanın. Hücre kültürü ekler (yaklaşık 300 μL) yüzeyinden aşırı medya kaldırın.Not: Hava kabarcıkları genellikle hücre kültürü ekler altında sıkışıp alabilirsiniz gibi, yavaşça bu kabarcıklar kurtulmak için ekler Tilt gerekli olabilir. Hücre kültürü eklemek için daha fazla glial hücreler eklenirse, daha fazla yıkama ve santrifüjün adımları hücre hayatta kalma için zararlı olabilir aşırı tripsin, kaldırmak için gerekli olabilir.