התא הראשי תרבות של מטוהרים GABAergic או Glutamatergic נוירונים הוקמה באמצעות מיון תאים פלואורסצנטית מופעל

כל ההליכים ותחזוקת בעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיים, חוק רווחה בעלי חיים גרמני והוראת המועצה האירופית 86/609/EEC לגבי הגנה על בעלי חיים, בנוכחות הרשאות מקומיות הרשויות (LaGeSo ברלין, T-0215/11). הערה: פרוטוקול זה מתאר את התרבות של נוירונים מטוהרים מעכבר הטרנסגניים יחיד או גור עכברוש (יום הלידה 0 – 2). יש לבצע את כל הטכניקות בתנאים סטריליים. כל הפתרונות צריך להיות מעוקר באמצעות מסנן 0.2 יקרומטר (ראה טבלת חומרים). שמיכות זכוכית וכלים לחיתוך צריך להיות מעוקר חום עבור 3 h ב 185 ° c. 1. כיסוי זכוכית ציפוי עם פולי-L-ליזין הכנת שמיכות זכוכית על ידי הפשרה 5 mL סדרת מחלקים של 200 μg/ml פולי-L-ליזין (pll) פתרון. לדלל את הפתרון מניות זה 20 μg/mL על ידי הוספת 45 mL של מים טהור כיתה הזרקה. סינון-לחטא את הפתרון לתוך צינורית 50 mL חדשה. סמן צינור זה כמו “מעקר PLL”.הערה: להשתמש במים המאוחסנים בטמפרטורת החדר כדי להאיץ את תהליך הפשרה. הוסף 100 סטרילי, עגול, 12 מ”מ שמיכות זכוכית לפתרון PLL סטרילי. מתפרעים הצינור כל 5 – 10 דקות, עבור 2 – 3 דקות, כדי להבטיח ציפוי אפילו. . בסדר.הערה: שמיכות זכוכית עגולות מתוצרת גרמניה (קוטר = 12 מ”מ) הינן מועדפות, כאשר הן מספקות משטח תרבותי אמין ומתאימות בקלות לתוך הבארות של לוחית התרבות הסלולרית הפתוחה 24 שעות ביממה. לאחר 40 דקות של ציפוי PLL, לקחת 2 פיסות נייר טישו ולהניח אותם שטוח בארון הזרימה. לחטא את הנייר באמצעות 70% אתנול, לאחר מכן לשטח כדי להסיר קמטים ולעזוב להתייבש. לאחר ציפוי זכוכית שמיכות עבור 1 h עם PLL, להסיר את הפתרון PLL עודף ולהוסיף סטרילי הזרקה מים כיתה. בעדינות מתפרעים את שמיכות עבור 2 – 3 s כדי לאפשר הסרה של העודפים PLL. חזור על שלב זה שטיפה 2 פעמים נוספות. הסירו את המים העודפים ולאחר מכן העבירו את הכיסויים לנייר הטישו הסטרילי. בזהירות להפריד כל שמיכות באמצעות מלקחיים מעוקל ולעזוב להתייבש.הערה: שוברי כיסוי שאינם נפרדים בקלות ניתנים למחיקה. לחילופין, ניתן להוסיף כמות קטנה של מים כדי לסייע להפרדה. לאחר ייבוש, להעביר את הכיסויים לצלחת התרבות 24 היטב.הערה: כיסוי צריך להיות מוכן כ 30 דקות – 1 h לפני תחילת תהליך הניתוח. ניתן לאחסן צלחות בחממה ב-37 ° c ו-5% CO2 עד לצורך. 2. דיסוציאציה של היפוקמאל ורקמה קורטיקלית הכנת פתרונות לתרבות התאים עבור הדיסוציאציה של רקמות עצביות, ראשית להפשיר a 40 mL מאגר של תרבות התא (הרכב [ב mM]: 116 הנאל, 5.4 KCl, 26 נחקו3, 1.3 נה2PO4, 1 mgso4· 7h2o, 1 קאסול2· 2h2o, 0.5 edta · 2Na · 2Na2O ו -25 D-גלוקוז, pH = 7.4). מדידת 12 מ ל של מאגר תרבות התא ל 15 מ”ל צינור חרוט; תווית כ-“BSA”. מדידת 5 מ ל של מאגר תרבות התא כדי שפופרת 15 mL שונים; תווית כ-“papain”. מודטה שתי הצינורות באמבט מים 15 דקות ב 37 ° c. סינון-חטא את המאגר הנותר של תרבות התא, תווית כ-“סטרילי מאגר” ואחסן ב-4 ° צ’ עד הצורך. שוקלים 120 מ”ג של סרום אלבומין (BSA) ומוסיפים לצינור המסומן” BSA “. שוקלים 7 מ”ג של פפאין ולהוסיף את הצינור המסומן” פפאין “. להחזיר את שני הצינורות לאמבט מים 15 דקות.הערה: זה מועיל להוסיף כמות קטנה של מאגר לסירה שוקלים כדי להקל על העברה של אבקת פפאין. לאחר כל האבקות יש התפרקה, מסננים לעקר כל פתרון לצינור חדש 15 מ ל חרוט. עבור papain צינור, תווית את הפתרון המסונן כמו “papain-סטרילי”. עבור BSA צינור, לחלק את הפתרון BSA סטרילי ל 3 צינורות, כל אחד המכיל 4 מ ל של פתרון BSA. סמן כל צינור כ-“BSA-סטרילי” ו-“1”, “2” או “3”. החזר את כל הצינורות בחזרה לאמבט מים ולהמשיך הדגירה ב 37 ° צ’ עד הנדרש. הכנה לניתוח רקמות קח חתיכה אחת של נייר מסנן 35 מ”מ (ראה טבלת חומרים) ולעקר עם 70% אתנול; משאירים להתייבש במכסה של צלחת פטרי ב100 מ”מ, בתוך ארון זרימה. כבו את המספריים, מלקחיים, אזמל ומרית (ראו טבלת חומרים) הנדרש לניתוח ההיפוקמפוס וקליפת המוח. מניחים 2 35 מ”מ מנות פטרי וצלחת פטרי 100 מ”מ המכילה נייר סינון סטרילי במיקום נגיש במרכז של ארון הזרימה. אסוף את היצורים הטרנסגניים; Ai9 ו VGAT ונוס כלבלבים העכבר שיש לגזור. השתמש מנורה פלואורסצנטית עם עירור מתאים ומסנני פליטה (ראה טבלת חומרים) כדי להפלות גורים פלורסנט מן הסוג פראי החברים. מיד לפני מבתר בעלי חיים, למלא כל 35 מ”מ צלחת פטרי עם קירור, סטרילי תרבות התא מאגר.הערה: צלחת פטרי אחת היא לנקות את הכלים בין הניתוח, והשני הוא לאיסוף ההיפוקמפוס והקליפה. ניתוח רקמות ברגע שנוצר מאגר תרבות התא, ערוף את ראשו של יום אחרי הלידה 0 – 2 שימוש בעכבר או גור חולדה באמצעות מספריים גדולים, חדים ולהשתמש בצלחת פטרי 100 mm סטרילי להעביר את הראש לתוך הארון הזורם. השתמש מלקחיים, מספריים ומרית כדי להעביר בזהירות את המוח של הגור הטרנסגניים לנייר סינון סטרילי. השתמשו בסוג 22 אזמל כדי לנתח את המוח השני ולהפריד את 2 האונות. השתמש במרית קטנה כדי לגלגל את המיספירה. בכל חצי כיתה, לחץ בעדינות כדי שקליפת המוח תבוא במגע עם נייר הסינון. הזיזו בעדינות את אזורי המוח כדי לחשוף את ההיפוקמפוס ואת הקליפה.הערה: להיזהר לא להחיל יותר מדי לחץ כאשר לוחצים על האונות או התאים יכול להיות מרוסק. השתמש אזמל או מרית כדי להפריד את ההיפוקמפוס ואת הקליפה של כל האונה. העבר רקמת בגזור לצלחת פטרי 35 מ”מ המכיל מאגר תרבות התא מקורר.הערה: אם מבתר בעלי חיים מרובים, לאחסן מאגר תרבות התא סטרילי בשפופרת 50 mL חרוט על קרח. לאחר כל ניתוח, להעביר לגזור רקמה למאגר מקורר תרבות התא. לאחר הניתוח המוצלח של רקמות קורטיקו-היפוקמאל, העבירו את התמיסה הפעין הסטרילית מאמבט המים לארון הזרימה. השתמש בצינורות 3 מ”ל כדי להעביר את ההיפוקמפוס וקליפת המוח למכסה של צלחת פטרי 35 mm סטרילי. קוצצים את התנועה כריס לחצות, באמצעות החלק השטוח של מסוג 22 אזמל, עד הרקמה היא חתיכות קטנות. השתמש כמות קטנה של פתרון פפאין להעביר את הרקמה קצוץ מן המכסה של צלחת פטרי לצינור פפאין סטרילי. להחזיר את צינור פפאין לאמבט מים ו מודטת את הרקמה ב 37 ° c עבור 25 דקות. במהלך הדגירה פפאין, להפוך את הפתרון מלאה התקשורת הפלואורסצנטית. הפשרה 1 מ”ל סדרת מחלקים של B27, a 0.5 ml של גלוטמקס ו 0.5 ml סדרת מחלקים של עט-דלקת. מ48.5 mL של שינה מדיה בעלי זריחה נמוכה לשפופרת מ50 mL. הוסף B27, גלוטמקס ו-עט-דלקת לפתרון. טלטל את הפתרון היטב, ולאחר מכן סנן ושנה תווית כ-“שינה מדיה שלמה” (עם תאריך וראשי תיבות). מודטה ב 37 ° c באמבט מים. לאחר הדגירה פפאין, להעביר את פפאין-tube ו-bsa סטרילי-צינורות אל הארון לזרום. השתמש בפיפטה 1 mL כדי להסיר רק את רקמת ההיפוטיקו-היפוקמאל מצינור פפאין לתוך bsa-tube 1.הערה: לטפל למזער את ההעברה של הפתרון העודף פפאין. דיסוציאציה של תאים כדי לשבור את כל הגושים הגדולים של רקמות, קצוצות את הרקמה מספר פעמים באמצעות 1 mL פסטר הצינורות. לאחר מכן, קצוצות את הרקמה 7 פעמים באמצעות טיפ דק הצינורות פסטר. להשאיר את הרקמה לעמוד במשך 30 s, המאפשר פיסות גדולות של רקמות לשקעים. לאחר 30 s, להעביר את הנמוך 1 mL של הפתרון והרקמה מ-BSA-tube 1 כדי BSA-tube 2. Triturate את הרקמה BSA-tube 2 מספר פעמים באמצעות טיפ דק הצינורות פסטר. לאחר trituration, להעביר שוב את התחתון 1 mL של רקמות ותמיסת BSA-tube 1, אבל עכשיו BSA-tube 3. Triturate את הרקמה BSA-tube 3 מספר פעמים באמצעות טיפ דק הצינורות פסטר. לאחר trituration, להעביר את כל הפתרונות והרקמות מצינורות 2 ו-3 לתוך BSA-tube 1. Triturate עוד 2-3 פעמים וצנטריפוגה ב 3,000 x g עבור 3 דקות. במהלך צנטריפוגה, להפוך את מלאה עצבי בסיס מדיה (מדיה NBA). Aliquot 48.5 mL של מדיית ה-NBA כדי 50 מ ל שפופרת חרוט ו דגירה ב 37 ° c באמבט מים. סמן את הצינור “NBA בלבד”. בנוסף, להפשיר 1 מ”ל סדרת מחלקים של B27, a 0.5 מ”ל סדרת מחלקים של גלוטמקס ו 0.5 mL הסדרת מחלקים של עט-דלקת בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה, להסיר בזהירות את supernatant מן הרקמה הפלטד ולהשעות מחדש את התאים 2 מ ל של מדיה מלאה. השתמש בפיפטה P1000 כדי להפעיל את הרקמה למעלה ולמטה 20 פעמים.הערה: לדאוג לא לפיפטה את התאים נמרצות מדי. אם מוחל יותר מדי לחץ, התאים עלולים להינזק. השתמש בפיפטה 1 mL כדי לסנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 30 יקרומטר לתוך צינור לדוגמה פוליסטירן.הערה: אם ההשעיה התא אינו עובר מיד דרך מסננת התא, ייתכן שיהיה צורך ללחוץ על גבי המכתש עם כפפה סטרילית כדי להתחיל את הזרימה. צעד חשוב זה מונע סתימה של סדרן התא. עבור איסוף נוירונים לאחר מיון, להכין צינורות איסוף ידי pipetting 300 μL של מדיה מלאה למספר הנדרש של צינורות פוליפרופילן. ההשעיה התא הוא עכשיו מוכן להילקח סדרן התא למיון. קח את ההשעיה התא, שפופרות אוסף נוסף ומדיה מלאה רזרבי במקרה דילול המדגם נדרש. 3. תא מיון מטוהרים GABAergic או Glutamatergic נוירונים הערה: כדי למזער את הסיכוי של זיהום חיידקי במהלך מיון לשטוף את אבובים לדוגמה של הסדרן עם 70% אתנול עבור לפחות 5 דקות לפני מיון. פרמטרי מיון מפורטים משתנים בין המכשירים, שיקולים יסודיים הם כדלקמן. במהלך מיון התא הראשון, ליצור רמות של זריחה ברקע מתאים ללא תווית על ידי מיון והשוואת תאים מחיה סוג פראי. עבור כל סוג תא פלורסנט להיות ממוין, בחר את עירור המתאים ומסנני פליטה. לרגש ונוס וחלבונים TdTomato באמצעות 488 ננומטר או 531 אורכי גל עירור ננומטר, בהתאמה. זיהוי האור הנפלט באמצעות 530/40 ו 575/30 ערכות מסנני פליטה, בהתאמה. הוסף צינורות אוסף פוליפרופילן, המכיל 300 μL של מדיה מלאה, כדי סדרן התא עבור אוסף התא. לטוהר גבוה, מיין את תאי הפלורסנט המסומנים בבהירות (ראה איור 1B לדוגמה, חלקות של תאים ממוינים). לאחר המיון, לקבלת תוצאות אופטימליות, בצע בדיקת טוהר של התאים הממוינים כדי להעריך את רמות הטוהר. שימו לב שקצב ההתאוששות האופייני של תאים אחרי המיון הוא בין 70 ל-80%. שים לב למספר התאים הממוינים בכל צינור גבייה. ערך זה ניתן על ידי מכשיר מיון התא.הערה: מיון התא ניתן לבצע באמצעות זרבובית 70 יקרומטר (70 psi לחץ נוזל מעטפת) או הצינור 100 יקרומטר (20 מעטפת psi לחץ נוזל). 4. culturing של נוירונים מיון לאחר מיון התא, להעביר תאים שנאספו 2 mL בסיבוב התחתון צינורות הצנטריפוגה, באמצעות 1 mL פסטר הפיפטה. צנטריפוגה את התאים ב 3,000 x g עבור 3 דקות כדי ליצור גלולה תא.הערה: כדי לעזור לזהות את המיקום של הגלולה תא, להתמצא את צינורות הצנטריפוגה העגול התחתון עם ציר של המכסה הפונה כלפי חוץ, אשר מאפשר את הגלולה התא לטופס על גב הצינור צנטריפוגה (כלומר, באותו צד של הצינור כמו הציר). במהלך צנטריפוגה, להוסיף 1 מ ל של B27, 0.5 mL של גלוטמקס ו 0.5 mL של עט-דלקת ל 48.5 mL של מדיה טרום מחומם לפני השימוש ב-NBA. טלטל את הפתרון היטב, ולאחר מכן סנן עיקור ותווית כמו “מדיה להשלים ב-NBA” (עם תאריך וראשי תיבות). חזרו לאמבט מים עד הצורך. לאחר צנטריפוגה, השתמש בצינורות 1 מ”ל כדי להעביר את הסופרנטאנט לצינור צנטריפוגה שונה (לשמור על המקרה של הגלולה הסלולרית היתה מופרעת). מחדש להשעות את הגלולה התא בסכום הנדרש של טרום התקשורת המלאה של ה-NBA כדי להשיג צפיפות תא של 1,000 תאים/μL. Re-להשעות את התאים על ידי ליטוף למעלה ולמטה עם P200 או P1000 הצינורות. כדי לאשר את הנוכחות של תאים שאינם מותתים, בדוק את פתרון התא תחת מיקרוסקופ, באמצעות עדשה 4x או 10x אובייקטיבי. לחילופין, פיפטה כמות קטנה של תמיסת תאים על שמיכות ולבדוק מתחת למיקרוסקופ. אם קיימים מספר גדול של תאים, ניתן למחוק את הסופרנטאנט משלב 4.3. לפני ציפוי התאים, מערבולת על מהירות בינונית עבור 2 – 3 s כדי להבטיח השעיית תא אפילו. בעקבות vortexing, במהירות פיפטה 10 μL של התא הבולם למרכז של כל שמיכות. לאחר ליטוף התאים, להחזיר במהירות כל צלחת לחממה (5% CO2/37 ° c) ו הדגירה עבור 1 h.הערה: אם הוספת תאים ללוחות מרובים של 24 שעות, יש לוודא שאפילו צפיפויות תאים באמצעות התאים הורתוניים בין לוחות. אחרי 1 h, להאכיל את התאים עם 500 μL של מדיית ה-NBA להשלים מראש ולחזור לחממה.הערה: בעת הזנת התאים, חשוב לפיפטה את התקשורת בעדינות במורד הצד של הבאר כדי למנוע ניתוק תאים. עבור ניסויים קצרים (< 16 ימים), האכלה בצפיפות הנ ל אינה הכרחית. בעת ציפוי של צפיפות גבוהה יותר של תאים, ניתן יהיה לדרוש מרווחי הזנה תכופים יותר (ראה דיון). 5. אסטרוציט מועשר בתרביות תמיכה גליאל הערה: הייצור של תרבויות גליה14 והשימוש בתוספות תרבות תאים תואר בעבר12. בקצרה, האסטרוציט מועשר בתרבויות גליה נגזרות של רקמת היפוקמאל (עם הסרת קרום המוח; P2 – P5), אשר היו מתורבתים לשבוע אחד על 20 μg/mL PLL-מצופה בצלחות 6-טוב, בסרום שיושלם DMEM מדיה. כדי שיתוף התרבות מטוהרים נוירונים ותאי גליה, מעבר תאים גליה שוטפת למספר הנדרש של תרבית תאים מוסיף (0.4 יקרומטר הנקבוביות גודל — ראה טבלת חומרים). כדי לעבור את התאים, להסיר צלחת 6-היטב המכיל תאים גליה שוטפת מתוך החממה ולשטוף 2 בארות, 2 פעמים, עם 2 מ ל של מחומם מראש (37 ° c) פוספט מלוחים באגירה (PBS). מP1000 את פתרון ה-PBS ומשתמשים בפיפטה להוסיף 1 מ ל של טריפסין מחומם (37 ° c) (1:250)/edta (0.25%/0.02%) פתרון לכל באר. להחזיר את הצלחת 6-היטב לחממה ולבדוק כל 2 – 3 דקות עבור התנתקות התא. לאחר ניתוק תא משמעותי אירע, פיפטה את התאים ואת פתרון התאים בעדינות למעלה ולמטה באמצעות טיפ דק פסטר הפיפטה, כדי לסייע לניתוק נוסף והפרדה של תאים בודדים. העבר את פתרון התא ל 15 מ”ל שפופרת חרוטי ו צנטריפוגה ב 3,000 x g עבור 3 דקות. מחדש להשעות את התאים באמצעות מP1000 בתוך 5 מ ל של טרום מחומם (37 ° c) התקשורת המלאה של ה-NBA על ידי ליטוף בעדינות למעלה ולמטה עד הגלולה התא הוא בפתרון. בצע ספירת תאים באמצעות המוגלובין או מונה תאים אוטומטי.הערה: לאחר 7 ימים בתרבות, כ 750000-1000000 תאים ניתן לקצור מכל באר של 6-היטב צלחת. לוח 40,000 גליה תאים לכל תרבות תא להוסיף ב-500 μl) droplet (80 תאים/μl). לאחר המאפשר לתאים לדבוק 1 h, השתמש מלקחיים סטרילי להעביר מכוסה glial תרבות התא מוסיף לצלחות 24-היטב המכיל נוירונים מטוהרים. הסרת מדיה עודפת מהמשטח של מוסיף תרבות התא (כ-300 μL).הערה: כמו בועות האוויר יכול בדרך כלל להיות לכוד מתחת מוסיף תרבות התא, ייתכן שיהיה צורך להטות בעדינות את התוספות להוציא אלה בועות. אם התאים גליה יותר נוספים להוסיף תרבות התא, שטיפת כביסה ושלבי צנטריפוגה עשוי להידרש כדי להסיר טריפסין עודף, אשר יכול להיות מזיק להישרדות התאים.