荧光活化细胞分选建立纯化的 Gabaep 或谷胱甘肽神经元的原代细胞培养

所有程序和动物维护都是根据机构准则、《德国动物福利法》和欧洲理事会关于保护动物的第86/609/EEC 号指令进行的, 并得到了当地地方的许可。(Lgeso Berlin, T-021511)。 请注意:该协议描述了从单个转基因小鼠或大鼠幼崽纯化神经元的培养 (产后天 0–2)。所有技术都应在无菌条件下进行。所有溶液都应使用0.2μm 过滤器进行灭菌 (参见材料表)。玻璃盖板和解剖工具应在185°c 下进行3小时的热处理。 1. 多-l-赖氨酸镀膜玻璃盖板 通过除霜200μgml 多 l-赖氨酸 (PLL) 溶液进行5毫升的玻璃盖板制备玻璃盖板。加入45毫升的纯注入级水, 将该库存溶液稀释至20μg/ml。将溶液过滤后灭菌成一个新的50毫升锥形管。将此管标记为 “PLL 无菌”。请注意:使用储存在室温下的水加快除霜过程。 在无菌 PLL 溶液中加入100个无菌、圆形、12毫米玻璃盖板。每5-10分钟搅拌一次管, 2-3分钟, 以确保均匀的涂层。用这种方式把被单涂上1小时。请注意:德国制造的圆形玻璃盖板 (直径 = 12 毫米) 是首选, 因为它们提供了可靠的培养表面, 很容易地融入24井细胞培养板的井。 在锁相环涂层40分钟后, 取2张纸巾, 并将其平铺在流动柜中。用70% 乙醇对纸张进行消毒, 然后扁平去除折痕, 然后离开干燥。 用锁相环涂覆玻璃覆盖物1小时后, 去除多余的 PLL 溶液, 加入无菌注射等级的水。轻轻搅拌2-3 秒的盖板, 以去除多余的 PLL。重复此冲洗步骤2次。 去除多余的水, 然后将盖板转移到无菌纸巾上。使用弯曲的钳子小心地分离每个盖板, 然后离开干燥。请注意:不容易分离的封面板可以丢弃。或者, 可以添加少量的水, 以帮助分离。 一旦干燥, 将盖板转移到24井培养板上。请注意:在开始解剖过程之前, 应在大约 30 min–1小时内准备好盖板。板材可存放在37°c 和 5% co 2 的孵化器中, 直至需要. 2. 海马和皮质组织的分离 细胞培养溶液的制备 为了神经组织的离解第一次解冻40毫升的细胞培养缓冲液 (成分 [在 m]: 116 氯化钠, 5.4 Kcl, 26 Nahco 3, 1.3 Nah2po 4, 1 MgSO 4·7h2 o, 1 ccl 2·2h 2H, 0.5 edta ·2Na·2H2o和 25 d-葡萄糖, ph 值 = 7.4)。将细胞培养缓冲液的12毫升测量到15毫升的锥形管;标签为 “BSA”。将5毫升细胞培养缓冲液测量到不同的15毫升管;标签为 “木瓜蛋白酶”。在37°c 的水浴中将两个管培养15分钟。 过滤消毒剩余的细胞培养缓冲液, 标签为 “缓冲-无菌”, 并存储在 4°c, 直到需要。 称量120毫克的牛血清白蛋白 (BSA), 并添加到标记为 “BSA” 的试管中。称量7毫克木瓜蛋白酶, 并添加到标记为 “木瓜蛋白酶” 的管。将两管送回水浴15分钟。请注意:在称重船上添加少量缓冲液是有帮助的, 便于木瓜粉的转移。 一旦所有粉末溶解, 过滤消毒每个溶液到一个新鲜的15毫升锥形管。对于管木瓜, 将过滤后的溶液贴上 “木瓜-无菌” 的标签。对于 BSA 管, 将无菌 BSA 溶液分成3个管, 每个管包含4毫升的 BSA 溶液。将每个管标记为 “BSA-无菌” 和 “1”、”2″ 或 “3”。将所有管道送回水浴中, 并在37°c 下继续孵育, 直到需要。 组织解剖的准备 取一张35毫米滤纸 (见材料表), 用70% 乙醇消毒;留在100毫米 Petri 培养皿的盖子里, 放在流动柜里晾干。 放置海马和皮层解剖所需的剪刀、钳子、手术刀和铲子 (见材料表)。 将两个35毫米 Petri 培养皿和一个含有无菌滤纸的100毫米 Petri 培养皿放在流动柜中央的无障碍位置。 收集转基因 NexCre;Ai9 和 VGAT 金星老鼠幼崽将被解剖。使用具有适当激发和发射过滤器的荧光灯 (见材料表) 来区分荧光灯幼崽与野生类型的垃圾。 在解剖动物之前, 用冷冻的无菌细胞培养缓冲液填充每个35毫米的 Petri 培养皿。请注意:一个培养皿是用来清洗解剖之间的工具, 另一个是用来收集海马和皮层。 组织解剖 一旦细胞培养缓冲液倒入, 用大的、锋利的剪刀将产后一天0-2 转基因小鼠或大鼠小狗斩首, 并使用无菌的100毫米 Petri 培养皿将头部转移到流动柜中。使用钳子、剪刀和铲子小心地将转基因小狗的大脑转移到无菌滤纸上。 使用22型手术刀解剖小脑, 并分离2个半球。使用一个小铲子横向滚动半球。在每个半球上, 轻轻按下, 使皮层与滤纸接触。轻轻移动中脑区域, 以揭示海马体和皮层。请注意:当压在半球或细胞可能会被压碎时, 要注意不要施加太多的压力。 使用手术刀或铲子将海马体和皮层从每个半球分开。将解剖组织转移到含有冷冻细胞培养缓冲液的35毫米 Petri 培养皿中。请注意:如果解剖多个动物, 将无菌细胞培养缓冲液储存在冰上的50毫升锥形管中。每次解剖后, 将解剖组织转移到冷冻细胞培养缓冲液中。 成功解剖皮质-海马组织后, 将无菌木瓜蛋白酶溶液从水浴转移到流动柜。使用3毫升的巴斯德移液器将解剖的海马体和皮层转移到一个不育的35毫米 Petri 培养皿的盖子。用22型手术刀的扁平部分进行纵横交错的运动, 直到组织成小块。 使用少量的木瓜蛋白酶溶液将切碎的组织从培养皿的盖子转移到无菌木瓜蛋白酶管。将木瓜蛋白酶管送回水浴中, 在37°c 孵育组织25分钟。 在木瓜蛋白酶孵育过程中, 制作完整的荧光培养基溶液。除霜 B27 的1毫升, 格拉塔玛克斯的0.5 毫升, 平链的0.5 毫升。将低荧光介质的48.5 毫升倾斜到50毫升的锥形管。添加 B27, 谷氨酸和彭瑞到溶液中。把溶液摇匀, 然后过滤消毒, 并将其标记为 “Hibernate 一个完整的介质” (带有日期和首字母)。在37°c 的水浴中孵化。 木瓜蛋白酶孵育后, 将纸管和无菌 bsa 管转移到流动柜。使用1毫升的巴斯德移液器, 只去除皮质海马组织从木瓜蛋白酶管到 bsa 管1。请注意:注意尽量减少过量木瓜蛋白酶溶液的转移。 细胞的分离 为了分解任何大型组织团块, 使用1毫升的巴斯德移液器对组织进行几次三尖血化。接下来, 使用一个细尖巴斯德移液器对组织进行7次三分法处理。让组织站立 30秒, 使较大的组织进入沉积物。 30秒后, 将溶液和组织的较低 1 mL 从 bsa 管1转移到 bsa 管2。使用细尖巴斯德移液器多次对 bsa 管2中的组织进行气管化。 经过三化, 再将较低的1毫升组织和溶液从 bsa 管1转移到 bsa 管3。使用细尖巴斯德移液器对 bsa 管中的组织进行了几次。 经过三化后, 将所有溶液和组织从2号和3号管转移到 bsa 管1中。再进行2-3 次的触控, 离心 3分钟, 3, 000 x克。 离心过程中, 制作完整的神经基部 a 媒体 (NBA 媒体)。将48.5 毫升的 NBA 培养基注射到50毫升的锥形管, 并在37°c 的水浴中孵育。标记此管 “仅限 NBA”。此外, 在室温下解冻 B27 的1毫升, 0.5 毫升的谷氨酸, 0.5 毫升的奔腾 Aliquot。 离心后, 小心地从颗粒组织中取出上清液, 并在2毫升的完整培养基中重新悬浮细胞。使用 P1000 移液器将组织上下三度旋转20次。请注意:注意不要把细胞移液太用力。如果施加过多的压力, 细胞可能会损坏。 使用1毫升巴斯德移液器将细胞悬浮液通过30μm 的电池筛子过滤成聚苯乙烯样品管。请注意:如果细胞悬浮液没有立即通过细胞筛子, 可能需要用无菌手套按压筛子的顶部, 以启动流动。这一重要步骤可防止细胞分拣器堵塞。 为收集神经元分类后, 准备收集管通过移液300μl 的完整介质到所需数量的聚丙烯管。 细胞悬浮液现在已经准备好被带到细胞分拣器进行排序。采取细胞悬浮液, 额外的收集管和备件完整的介质, 以防样品稀释是必需的。 3. 纯化的 Gabaep 或谷氨酸神经元的细胞分选 请注意:为了最大限度地减少分选过程中细菌污染的可能性, 请在分拣前用70% 乙醇冲洗分拣机的样品管至少5分钟。详细的分类参数因仪器而异, 基本考虑如下。 在第一次细胞分类过程中, 通过对野生类型动物的细胞进行分类和比较, 建立未标记细胞的背景荧光水平。 对于要排序的每个荧光电池类型, 选择适当的激发和发射过滤器。分别使用 488 nm 或 531 nm 激发波长激发金星和 TdTomato 蛋白。通过 530/和530/40 发射过滤器分别探测发射光。 在细胞分拣机中加入含有300μl 的完整介质的聚丙烯收集管, 以便进行细胞采集。 对于高纯度, 请对标记明亮的荧光细胞进行排序 (例如, 参见图 1 b中的点图)。 在分类之后, 为了获得最佳结果, 请对已分类的细胞进行纯度测试, 以估计纯度水平。请注意, 分选后单元格的典型恢复率在70–80% 之间。 记下每个收集管中排序的单元格数。此值由单元格排序工具给出。请注意:可使用70μm 喷嘴 (70 psi 护套流体压力) 或100微米喷嘴 (20 psi 护套流体压力) 进行电池分选。 4. 培养排序神经元 在细胞分选后, 使用1毫升的巴斯德移液器, 将收集的细胞转移到2毫升圆形的底部离心管中。以 3, 000 x 克的速度离心细胞 3分钟, 形成细胞颗粒。请注意:为了帮助确定细胞颗粒的位置, 将圆的底部离心管定位, 盖子的铰链朝外, 这使得细胞颗粒形成在离心管的背面 (即与铰链在管的同一侧)。 离心过程中, 在预热的 NBA 媒体的48.5 毫升中加入1毫升的 B27、0.5 mL 的谷氨酸和0.5 毫升的彭斯特普。摇匀溶液, 然后过滤消毒和标签为 “NBA 完整的媒体” (日期和首字母)。返回到水浴, 直到需要。 离心后, 使用1毫升巴斯德移液器将上清液转移到不同的离心管 (在细胞颗粒受到干扰的情况下保留上清液).重新悬浮细胞颗粒所需数量的预热完整的 NBA 培养基, 以达到 1, 000 细胞密度, 通过用 P200 或 P1000 移液器上下移液重新悬浮细胞。 要确认是否存在离解细胞, 请使用4倍或10倍的物镜在显微镜下检查细胞溶液。或者, 将少量的细胞溶液输送到盖板上, 并在显微镜下进行检查。如果存在大量细胞, 则可以丢弃步骤4.3 中的上清液。 在电镀细胞之前, 以 2–3 s 的中等速度产生涡流, 以确保细胞的均匀悬浮。涡流后, 快速将细胞悬浮液10Μl 移至每个盖板的中心。移液细胞后, 迅速将每个细胞返回孵化器 (5% CO 2/37°c)并孵育1小时。请注意:如果将细胞添加到多个24孔板, 则通过板之间的涡流单元确保细胞密度均匀。 1小时后, 用500μl 预热完整的 NBA 培养基喂养细胞, 然后返回孵化器。请注意:在喂养细胞时, 重要的是将介质轻轻移入井口一侧, 以避免细胞脱离。对于短时间的实验 (和 lt;16 天), 不需要在上述密度下进食。当电镀更高密度的细胞时, 可能需要更频繁的进料间隔 (请参阅讨论)。 5. 星形胶质细胞丰富的胶质支持培养 请注意:胶质培养物的产生 14和细胞培养插入物的使用已在前面描述了12。简而言之, 富星形胶质细胞培养物来源于皮质-海马组织 (切除脑膜;P2–P5), 在血清中培养了一个星期的 20μgml pll 涂层6孔板, 在血清中补充了 DMEM 培养基。 要共同培养纯化的神经元和胶质细胞, 将胶质细胞融合到所需数量的细胞培养插入物 (0.4μm 的孔径–见材料表)。要通过细胞, 从孵化器中取出含有融合胶质细胞的6孔板, 用2毫升预热 (37°c) 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 清洗2口井, 2次。 吸收 PBS 溶液, 并使用 P1000 移液器添加1毫升预热 (37°C) 胰蛋白酶 (1:250)/EDTA (0.02/0.02%)每个井的解决方案。 将6孔板返回孵化器, 每2-3分钟检查一次细胞脱离。 一旦发生明显的细胞分离, 使用细尖巴斯德移液器轻轻上下移液细胞和细胞溶液, 以帮助进一步分离和分离单个细胞。 将细胞溶液以 3, 000 x g 的速度转移到15毫升的锥形管和离心机上, 时间为3分钟。 在预热 (37°c) Nba 完整介质的5毫升中使用 P1000 移液器重新悬挂细胞, 通过轻轻向上和向下移液, 直到细胞颗粒在溶液中。 使用血细胞计或自动细胞计数器执行细胞计数。请注意:经过7天的培养, 大约750000–100000细胞可以从一个6井板的每口井中收获。 将 40, 000 胶质细胞贴在每个细胞培养中插入500Μl 液滴 (80 细胞-Μl)。 在允许细胞坚持1小时后, 使用无菌钳将胶质覆盖的细胞培养插入到含有纯化神经元的24口板。从细胞培养刀片表面去除多余的介质 (约 300Μl)。请注意:由于气泡通常会被困在细胞培养插入物下方, 因此可能需要轻轻倾斜插入物以去除这些气泡。如果在细胞培养插入中添加更多的胶质细胞, 可能需要进一步的清洗和离心步骤来去除多余的胰蛋白酶, 这可能会损害细胞的存活。