Post-larval 表現型解析およびホール マウント免疫組織化学のためメキシコ テトラアステュアナクス メキシコの調達

このプロトコルで説明されている手順は、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ハーバード衛生学校によって承認されています。 1. 繁殖 注: この手順でまた使用できる15,16,17,20を繁殖のためいくつかの公開メソッドがあります。10:14: 明暗サイクルの 23 ° c、ペレット飼料で繁殖、以前に成魚が保持されます (を参照してください材料表) 1 日 1 回。魚は、機械的なろ過と紫外線殺菌循環システムで飼育することができます。静的 (非循環) タンクで繁殖を行うこともできますが、魚ままにしてはならない静的タンクで 3 日以上、水質が急速に低下します。 魚用の水 5 ガロン タンクを埋める (塩素水に調整: pH = 2、伝導率 ± 7.1 ± 150 μ 秒、温度 900 = = 23 ° C)。 プラスチックを置く (参照資料) をタンクの底にメッシュします。静的な水槽で飼育する場合は、タンクの側面に水ヒーターを貼付します。循環システムで飼育する場合に、システム排水給湯します。注意: プラスチック製のメッシュの卵を消費するから大人を防ぐ。 1 つの場所の女性と 2 つ男性A. メキシコタンクに 1 歳を超える魚します。30 分の適応する魚ができます。 ヒーターの温度を 24 ° C (または開始温度より暖かい 1 ° C) に設定します。 24 h 後 1 ° c の温度を増加します。 24 h 後 1 ° c の温度を増加します。タンクの底に懐中電灯を照らすことによって毎日卵のタンクを確認してください。この 3 日間の期間中に食品から魚を差し控えます。 3 日後に産卵を誘導されていないが場合、は、ヒーターを切り、魚を自分の元のタンクに移動する前に室温 (RT) に戻るには水を許可します。 2. 孵化受精卵 卵は飼育槽で識別される、大人とプラスチック製のメッシュを削除し、ビーカーやコップを使用した 10 cm の深さまで水を減らします。注: 産卵の時間を見積もるには、するには、シャーレにいくつかの卵を置き、ステージ14を決定し、受精の時間を推定する実体顕微鏡でそれらを表示する転送ピペットを使用します。 便利な作業面にタンクを移動し、不透明な卵や糞便、タンクで半透明、肥沃な卵だけを残して削除します。注: この時点で受精卵の数を記録できます。 塗りつぶし魚準備ができたとタンク (手順 1.1 参照) を水し、水が一杯になる水槽にメチレン ブルーの 6-7 滴を追加します。メモ: 最終的なメチレン ブルー濃度は約 1.5 ppm です。 タンクにヒーターと水槽バブラー (レギュレータの空気ポンプに接続されている) を追加します。 24 ° C にヒーターを設定し、泡の穏やかな流れを生成するエアストリーム レギュレータを調整します。 水の温度を維持するためにタンクにカバーを配置します。注: 卵は産卵時刻の 24 時間以内の孵化を開始する必要があります。 3. 保育所のコンテナーに孵化した幼虫の転送 塩 20 g を追加 (参照資料) 魚用の 8 L 水 (手順 1.1 参照) と溶解するまで攪拌します。各保育所の 1.5 L コンテナーを埋める (参照資料) 準備された水の 1 l。 転送ピペットを使用すると、コンテナーあたり 20 魚の密度で準備された保育所コンテナーに孵化した幼虫を移動します。注: ヘッドランプことができますを検索し、孵化した幼虫を転送します。 目に見えるすべての孵化幼虫が取り除かれた後、攪拌、および/またはエッジやピペットを使用してタンクのコーナーにウォーター ジェットを吹いているタンク内の水を揺り動かしなさい。注: このパスを最初に失敗した幼虫を明らかにするのに役立ちます。 未使用幼虫研究所福祉事務所 (OLAW) のガイドラインを使用してこの段階で処分します。6.15% の最終的な集中を達成するためにタンクに次亜塩素酸ナトリウムを加えます。シンクの下を注ぐ前に少なくとも 5 分を待ちます。 ラベルの日付と受精の時間各保育所のコンテナー。毎日保育所コンテナーを表示し、任意の死んだ幼虫の削除を続行します。 4. 魚のワムシ ベースの食品の準備 ワムシを取得については、材料表を参照してください。設定、保守、およびワムシ22を収穫する参照先のプロトコルに従ってください。 魚を準備藻類混合の 3 mL を追加することによって食品 (材料の表を参照してください) 収穫されたワムシの 1 L にします。この混合物は、食品の供給として保育所コンテナーに直接追加されます。 5. 後仔魚の餌 魚が 5 日後に受精 (dpf)、魚料理 (4.2 の手順で準備) の 3 mL を各保育所のコンテナーに追加します。最適密度でワムシはコンテナーの中心に、育苗容器のコーナーで密集したグループで表示されより少なく明白にする必要があります。適切な密度に達するまで追加ワムシの混合物を追加します。 ワムシの存在のために毎日コンテナーを確認し、枯渇の濃度を取得する場合追加。任意の死んだ幼虫の削除を続行します。 魚に達する 14 dpf と、5 魚/L の水の密度で循環システムと合うタンクに移動します。注: この時点で後仔魚の生存数を記録できます。 6 後仔魚のホール マウント免疫組織染色 ナイロンを通して魚を含んでいる保育所のコンテナーを注ぐことによって 24 時間食べ物から必要な段階の削除後稚魚メッシュのストレーナーと魚-準備ができてきれいな水を容器にこし器を配置すること (手順 1.1 参照)。注: それは食品のすべてを削除することが欠かせません。腸内で食べ物を少量でも自動蛍光、画像に影響を与えます。 収集し、魚を安楽死させます。注: 安楽死プロトコル OLAW ガイドラインに従う必要があり、制度的動物ケアおよび使用委員会によって承認されます。我々 は、単独で tricaine に後稚魚が安楽死させるないと魚が魚が氷の上も保管されていない場合、tricaine から定着へ転送時の移動を開始を指摘しています。 Tricaine-S の 0.4 g と炭酸水素ナトリウム 0.8 g を脱イオン水 1 リットルに追加してビーカーに tricaine ソリューションを準備し、氷の上に置きます。 魚を収集するためにナイロン メッシュのストレーナを介して魚を含む水を注ぐ。優しく冷たい Tricaine ソリューションでストレーナーが水没、氷上で 10 分おきます。 Euthanized 魚を修正します。 カットの先端の円錐管に魚を転送するのに転送ピペットを使用します。 転送ピペットと Tricaine ソリューションを削除し、固定液に置き換えます。ロッキングで孵化させなさい。注: 固定と固定時間は、使用抗体に基づいて決定する必要があります。4 ° C で一晩 10% ホルマリン溶液 (4% のホルムアルデヒド、資料を参照してください) は、材料の表に記載されている抗体に適しています。注意: ホルマリンは有毒、可燃性です。個人用保護具 (手袋、白衣、スプラッシュ ゴーグル) を着用し、フードは化学処理します。ホルマリンを含む溶液有害廃棄物として廃棄してください。 転送ピペットを使用して、魚を乱すことがなく、定着剤を慎重に取り外します。リン酸の 3 mL 緩衝生理食塩水-トリトン ソリューションを追加 [0.1 で PBS % トリトン (pbst;)、表示材料] ロッキング常温 15 分間インキュベートし、。 Pbst; を削除し新鮮な PBST に置き換えて、孵化の 15 分 1 つの追加の時間を「洗濯」この手順を繰り返します。注: 魚は数週間の 4 ° C では、0.02% アジ化ナトリウムを含む PBS に格納できます。 ホール マウント免疫染色を行います。 ソリューション [PB-0.5% トリトン X、0.2% ウシ血清アルブミン (BSA)、1% ジメチルスルホキシド (DMSO)、アジ化ナトリウム 0.02%、5% ロバ血清] ブロックの 50 mL を準備します。注意: アジ化ナトリウム、DMSO、有毒です。処理する際は、個人保護具 (手袋、白衣、スプラッシュ ゴーグル) してください。すべてのソリューションは、有害廃棄物として破棄されなければなりません。 スクリュー トップ キャップと 4 mL バイアルに魚を転送するのに転送ピペットを使用します。転送ピペットを使用して、pbst; を削除し、ソリューションをブロック 3 mL を加えます。ロッキング RT で 1 時間インキュベートします。 転送ピペットを使用して、ブロッキング ソリューションを削除し、ソリューションをブロックで希釈した一次抗体を追加します。撹拌で室温で一晩インキュベートします。注: たとえば、追加 1: 250 反-フク/HuD 神経蛋白質モノクローナル抗体の希釈 ( A. メキシコで正常に使用されている抗体のリストの材料表を参照してください)。魚の追加なしの一次抗体のセットは、この手順に含まれているべきです。抗体の量は魚をカバーでき、撹拌のために十分なはずです。 6.3.4 の手順の説明に従って PBST で 3 回魚を洗います。ソリューションをブロックで希釈した二次抗体と PBST を交換し、撹拌で RT 一晩インキュベートします。注: 最適な一次および二次抗体濃度、培養時間、培養温度各抗体で決定する必要があります。RT で一晩は材料の表に記載されている抗体のために効果的であった。 6.3.4 の手順で説明するように 15 分を持続させる各洗浄 PBST で 3 回魚を洗います。 解離性大、進む前に短期的なストレージのため PBS に魚を転送マウント、または魚を断面します。