Alzando la Tetra messicano Astyanax mexicanus per analisi di Post-larval fenotipi e Immunohistochemistry intero-monta
Summary
In questo protocollo, dimostriamo come allevare gli adulti Astyanax mexicanus , sollevare le larve ed eseguire immunohistochemistry intero-monta il pesce post-larvale per confrontare i fenotipi della superficie e Grotta morfotipi.
Abstract
Fiume e Grotta-adattato popolazioni di Astyanax mexicanus mostrano le differenze nella morfologia, fisiologia e comportamento. Ricerca incentrata sul confronto tra forme dell’adulto ha rivelato le basi genetiche di alcune di queste differenze. Meno è conosciuto circa come le popolazioni differiscono nelle fasi post-larvale (al momento della comparsa di alimentazione). Tali studi possono fornire la comprensione in come caverna sopravvivere fino all’età adulta nel loro ambiente naturale. Metodi per confrontare lo sviluppo post-larvale in laboratorio richiedono l’acquacoltura standardizzato e regimi di alimentazione. Qui descriviamo come allevare pesci su una dieta dei rotiferi di nutrienti in acqua di ricircolo per fino a fecondazione post due settimane. Dimostriamo come raccogliere pesci post-larvale da questo sistema di scuola materna ed eseguire intero-monta immunostaining. Immunostaining è un’interessante alternativa alle analisi di espressione del transgene per indagare lo sviluppo e la funzione del gene in a. mexicanus. Il metodo di vivaio utilizzabile anche come un protocollo standard per le popolazioni di densità-abbinati che stabilisce per la crescita in adulti.
Introduction
Il tetra messicano, Astyanax mexicanus, è una singola specie di pesce che esiste come fiume-abitazione popolazioni (superficie pesce) e un numero di caverne popolazioni (caverna) denominato per le grotte che abitano (cioè, Tinaja, Molino, Pachón). Un numero crescente di ricercatori sta utilizzando a. mexicanus di indagare le basi di genetiche ed evolutiva di comportamentale1,2,3,4, metabolica5,6 ,7,8ed evoluzione morfologica9,10,11. Risorse disponibili per gli studi di a. mexicanus includono un genoma sequenziato ed annotata12; transcriptome13; sviluppo gestione temporanea tabella14; e metodi per l’allevamento di15,16,17, transgenetica18di creazione e modifica dei geni19. Diffusione di ulteriori strumenti e protocolli standard aggiornati accelererà la crescita della comunità di ricerca di caverna (Vedi questa raccolta di metodi20).
Il nostro obiettivo è quello di aggiungere al repertorio degli strumenti esistente, fornendo un metodo affidabile per la valutazione gene attività in situ in post-larvale a. mexicanus, in modo paragonabile tra i laboratori. Ci sono due sfide per raggiungere questo obiettivo. In primo luogo, c’è una necessità di regimi standardizzati da cova e alzando il pesce tra i laboratori, come differenze nei parametri quali alimentazione e densità influenzano la crescita e maturazione, quindi influire sulle attività del gene. In secondo luogo, c’è la necessità di un metodo standardizzato ma adattabile per l’esame di modelli di attività del gene nel pesce post-larvale. Affrontiamo questi problemi qui, che istituisce procedure standard per l’allevamento dei pesci a stadi post-larvali e l’introduzione di un protocollo robusto intero-monta immunohistochemistry (IHC) per valutare l’espressione genica in a. mexicanus.
In primo luogo dimostriamo come allevare il pesce attraverso la deposizione delle uova naturali e identificare le uova fecondate. Avanti descritto sono come si schiudono le uova fecondate (larve) e trasferirli ai contenitori di vivaio, dove essi sono mantenuti ad una densità di 20 pesci per contenitore per due settimane senza ricircolo o cambiando l’acqua. Al momento della fecondazione post 5 giorni, i pesci hanno sviluppato a stadi post-larvali (non più avere una fornitura di tuorlo) e sono forniti di alghe-federazione Brachionus plicatilis (rotiferi) come fonte di cibo ricco di sostanze nutritive che non richiedono rifornimento giornaliero. Questo metodo fornisce i parametri di crescita coerente per lo sviluppo larvale e post-larvale.
Per valutare la funzione del gene, dimostriamo come rimuovere il pesce dai contenitori di vivaio ed eseguire intero-monta IHC. Il metodo IHC presentato è adattato da protocolli sviluppati per l’uso con Danio rerio21 ed è efficace per l’esame di antigeni in tutti i tessuti a. mexicanus provati, compreso il cervello, intestino e pancreas. IHC è un’alternativa più veloce alla generazione di animali transgenici per l’esame dell’espressione genica e la localizzazione della proteina. Questo protocollo sarà utile per studi volti a crescere a. mexicanus e confrontando i fenotipi dei pesci di superficie e caverna nelle fasi post-larvale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Confronto tra attività genica tra superficie e Grotta a. mexicanus richiede attentamente controllati parametri ambientali e metodi che possono essere replicati di laboratori. Il nostro protocollo per l’allevamento a. mexicanus fornisce contenuti nutrizionali coerenti durante lo sviluppo post-larvale. A seguito di questo regime alimentare, funzione del gene può essere paragonato con fiducia tra popolazioni utilizzando il protocollo robusto immunohistochemistry che presentiamo. Qui discutiamo l’importanza di questo metodo così come i suoi limiti e le applicazioni future.
Per realizzare una crescita pari densità, abbiamo trovato che pesce post-larvale può essere sollevata senza ricircolo dell’acqua per due settimane in contenitori di 1,5 L su una dieta dei rotiferi. Questo protocollo può anche essere usato per allevare pesci su un sistema di ricircolo; Tuttavia, rotiferi devono essere aggiunto ogni giorno per compensare quelli persi attraverso il deflusso di serbatoio. Naupli di Artemia appena schiusi sono comunemente usati come fonte di cibo in acquacoltura, ma abbiamo trovato che l’utilizzo di rotiferi ha notevoli vantaggi, tra cui: ridotto prezzo, biosicurezza migliorata, nutrizione coerente e migliore qualità dell’acqua (Vedi sotto).
In primo luogo, il costo settimanale dei consumabili è 4 dollari per rotiferi, rispetto a 14 dollari per artemie. Per quanto riguarda la biosicurezza, rotiferi sono allevati in laboratorio in condizioni controllate, mentre Artemia sono raccolti dal selvaggio e soggette a variazione naturale in microbica o agente patogeno Sommario23. Inoltre, la composizione nutrizionale dei naupli di Artemia sono ambientalmente determinati e pertanto incoerente. Naupli prosperano sulle proprie riserve di energia dopo la schiusa; perdono rapidamente valore nutritivo come sviluppano e dovrebbero essere alimentati in modo ottimale ai pesci all’interno di diverse ore. Artemia avviare l’alimentazione a 12 casa post-cova, che rappresenta la prima volta che potrebbe essere nutrizionalmente arricchiti; Tuttavia, in questa fase sono diventati troppo grandi per 5 dpf pesci a consumare. In confronto, rotiferi si nutrono continuamente di microalghe marine conseguente alto contenuto nutritivo indipendentemente da quando vengono raccolti i rotiferi. Rotiferi sono molto più piccoli di Artmeia naupli (160 vs 400 micron), che li rende più facile per il pesce catturare e inghiottire. Caverna e post-larvale superficie pesci consuma rotiferi in quantità simili non suggerendo alcuna differenza nella capacità di catturare i rotiferi10o preferenze.
Infine, Naupli di Artemia iniziano morendo in acqua dolce diverse ore dopo essere stato introdotto. Non vengono consumate naupli decadrà, rapidamente diminuendo la qualità dell’acqua, se non vengono rimossi manualmente. Rimozione di morto Artemia è che richiede tempo e pericoloso per i pesci post-larvale che non sono molto più grande di Artemia e potrebbero essere accidentalmente rimosso o feriti. Rotiferi possono vivere indefinitamente nei contenitori del vivaio e fornire cibo ai pesci in ogni momento senza influire significativamente sulla qualità dell’acqua.
Mentre utilizzando rotiferi come una fonte di cibo ha notevoli benefici, per mantenere le alghe stock, Rotifera deve essere aggiunto al sistema cultura ogni giorno. Questo può essere realizzato con un alimentatore automatico che eroga alghe liquide nel contenitore di cultura Rotifero (Vedi Tabella materiali). Rotiferi devono anche essere raccolto da questo set-up ogni 24-48 ore per mantenere la salute della cultura. I ricercatori che allevano i pesci molto raramente (una volta un anno, per esempio) e non si occupano di effettuare confronti tra le popolazioni nelle fasi post-larvale possono preferire Artemia come fonte di cibo, poiché gli embrioni incistati possono essere covati in qualsiasi momento.
Si consiglia di tenere traccia del numero di larve covate e superstite per monitorare il successo di schiusa e di crescita. Se la maggior parte del embrioni o larve muoiono, è possibile a causa di contaminazione batterica o fungina. Si raccomanda di monitorare la qualità dell’acqua dell’acqua pesce-pronto e sterilizzare qualsiasi apparecchiatura con etanolo al 70%. Contenitori di vivaio possono essere riutilizzati dopo averli puliti e sterilizzati. Per minimizzare il rischio di malattia, è anche fondamentale per rimuovere qualsiasi pesce morto dai contenitori di vivaio e non aggiungere rotiferi prima 5 dpf, quando i pesci cominciano a mangiare.
A. mexicanus sono sessualmente maturi a circa un anno di età. Si tratta di una limitazione per la generazione transgenica a. mexicanus rispetto a Danio rerio (pesce zebra) che sono in grado di riprodursi a 10-12 settimane24. Immunohistochemistry (IHC) è un metodo alternativo per studiare l’espressione genica e la localizzazione della proteina. Il protocollo descritto qui può essere adattato ad ogni passo e utilizzato per rilevare gli antigeni in qualsiasi tessuto di interesse. È importante notare, tuttavia, che alcuni tessuti possono essere più difficili da visualizzare in superficie pesci a causa della pigmentazione (una barriera che non esiste nella caverna unpigmented), che possono influenzare l’interpretazione degli studi comparativi. Per risolvere questo potenziale problema, superficie pesce pigmento può essere candeggiato dopo la fissazione utilizzando perossido di idrogeno 3%.
IHC richiede la fissazione di riuscita dei tessuti, il blocco e la penetrazione dell’anticorpo. Metodi per ciascuna variano a seconda del tessuto e la proteina di interesse. Il tempo di fissativo e la fissazione deve preservare architettura cellulare mantenendo l’epitopo dell’antigene. Per questo protocollo, utilizziamo un fissativo di cross-linking (paraformaldeide) e omettere un fissativo denaturante (come metanolo o acetone). Abbiamo trovato che incubazione in acetone diminuita segnale anticorpo per gli indicatori di un neurone e del pancreas. Il passo di blocco è essenziale per impedire gli anticorpi di associazione a proteine non bersaglio nel tessuto. Questo metodo utilizza una combinazione di siero normale (5%) e BSA (0,2%) nella soluzione di blocco. La soluzione bloccante contiene anticorpi e proteine che si legano a siti reattivi sulle proteine nel tessuto, diminuendo il legame non specifico degli anticorpi primari e secondari.
Per ottenere la penetrazione dell’anticorpo, il tessuto deve essere permeabilizzato. Questo può essere realizzato con detergenti o solventi denaturante, ma deve essere ottimizzato per preservare l’epitopo dell’antigene. Il nostro protocollo utilizza una combinazione di Triton e dimetil solfossido (DMSO). Triton e DMSO sono inclusi durante le fasi di incubazione dell’anticorpo e di blocco a concentrazioni di 0,5% e 1%, rispettivamente. Usando questa concentrazione, abbiamo osservato che macchia in cervello, pancreas, intestino e muscolare, suggerendo che è probabile efficace per la penetrazione di tutti i tessuti. Dimensione del pesce può anche influenzare la penetrazione. Questo protocollo non è stato testato sui pesci che sono superiori ai 14 giorni di età (circa 7 mm di lunghezza). Per risolvere i problemi di colorazione, si raccomanda di modificare la procedura di fissazione, blocco e anticorpo penetrazione. È anche importante esaminare la conservazione di sequenza dell’immunogeno con la proteina a. mexicanus di interesse utilizzando il genoma disponibili25.
A. mexicanus è un eccellente modello per studiare l’evoluzione come popolazioni della stessa specie che si sono evoluti in ambienti radicalmente diversi possono essere confrontate direttamente in laboratorio. Protocolli standard di allevamento, all’interno e tra laboratori, sono essenziali per comprendere le differenze biologiche tra superficie pesce e caverna. Nostro articolo fornisce un metodo per esaminare lo sviluppo e l’attività del gene in post-larvale pesci esposti ai parametri di crescita costante.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health [HD089934, DK108495].
Materials
| methylene blue | Kordon | B016CBHZUS | antifungal |
| heater | Finnex | 4711457836017 | 100W Digital Control Heater |
| airstone | Lee's Aquarium & Pet Products | 10838125202 | disposable air stone |
| salt | Instant Ocean | 51378014021 | Sea Salt |
| nursery container | IPC | 21545-002 | 40 oz or 1.5 L clear containers |
| transfer pipette | VWR | 414004-002 | plastic bulb pipettes |
| compact culture system(CCS) starter kit with Brachionus plicatilis (L-type) rotifers | Reed Mariculture | na | fish food |
| RGcomplete | APBreed | 817656016572 | 32 oz bottle of rotifer food |
| Programmable Auto Dosing Pump DP-4 | Jebao | DP-4 | automatic feeder for rotifers |
| Tricane-S | Western Chemical | MS 222 | fish anesthetic |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | for tricane solution |
| nylon mesh strainer | HIC (Harold Import Co.) | 735343476235 | 3-inch diameter |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixative |
| 10X PBS | Invitrogen | AM9625 | buffer, dilute to 1X using distilled water |
| Triton-x 100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | detergent |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | anti-bacterial |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100G | blocking reagent |
| glass vial with screw-top cap 4mL | Wheaton | 224742 | staining vial |
| plastic mesh screen for breeding tank | Pentair | N1670 | Cut into a rectangle 6mm larger on all edges than the dimensions of the bottom of the breeding tank. Cut a 6mm square from each corner of the rectangle. Bend the edges of the screen down along all four edges.Place a pair of 6mm vinyl-coated disk magnets on either side (top and bottom) of the mesh on each corner. The screen should be as snug as possible to the sides of the tank. The screen can be removed from the tank with a metal fish net. |
| vinyl-coated disk magnets | Kjmagnets | D84PC-AST | |
| New Life Spectrum Thera-A pellet fish food | New Life International | na | Adult fish food. A list of retailers for this product is available on the company website |
| Antibodies | |||
| insulin antibody from guinea pig | Dako | A0564 | 1:200 |
| glucagon antibody from sheep | Abcam | ab36215 | 1:200 |
| acetylated tubulin antibody from mouse | Sigma | T6793 | 1:500 |
| HuD/HuC antibody from mouse | Life Technologies | A-21271 | 1:500 |
| nitric oxide synthase (nNOS) antibody from rabbit | Abcam | ab106417 | 5μg/mL |
| choline acetyltransferase (ChAT) from rabbit | Abcam | ab178850 | 1:2000 |
| seratonin (5HT) from rabbit | Immunostar | 20080 | 1:500 |
Riferimenti
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