Summary

형태와 오픈 소스 소프트웨어 파이프라인 Agar에 움직일 활성된 슬러지 입자의 크기 측정

Published: January 30, 2019
doi:

Summary

활성된 슬러지 입자의 형태와 크기는 다양 한 방법을 사용 하 여 측정 하는 중요 한 매개 변수. 부정확 비 대표 샘플링, 차선 이미지 및 주관적인 분석 매개 변수에서 발생 한다. 이러한 오류를 최소화 하 고 쉽게 측정, 우리는 오픈 소스 소프트웨어 파이프라인을 포함 하 여 모든 단계를 지정 하는 프로토콜을 제시.

Abstract

그 치료 폐수 등 실험적인 bioreactors 입자의 크기와 모양이 중요 한 매개 변수를 포함 합니다. 예를 들어 크기와 활성된 슬러지 flocs의 모양 수는 눈금에서 조건을 나타내고 슬러지는 헤어 청 징 제에서 침전 하는 얼마나 잘에 직접적인 영향을 합니다.

입자 크기와 모양 모두 misleadingly ‘간단한’ 측정 있습니다. 많은 미묘한 문제가, 종종 비공식 프로토콜에 unaddressed 샘플링, 이미징, 및 입자를 분석 하는 경우 발생할 수 있습니다. 샘플링 방법 편견 수 있습니다 또는 충분 한 통계적 인 힘을 제공 하지. 샘플 스스로 가난 하 게 유지 될 수 있습니다 또는 동원 정지 하는 동안 변경 받 다. 이미지는 충분 한 품질;의 않을 수 있습니다. 겹치는 입자, 분야, 확대율, 그리고 다양 한 잡음의 깊이 수 모든 결과가 가난한. 잘못 지정 된 분석 편견, 수동 이미지 임계 처리 및 시장 세분화에 의해 생산 등 발생할 수 있습니다.

경제성 및 처리량 재현성 함께 바람직한 있습니다. 저렴 한 가격, 높은 처리량 방법 더 자주 입자 측정, 입자의 수천을 포함 하는 많은 이미지를 설정할 수 있습니다. 저렴 한 시 약, 일반적인 해 현미경, 그리고 자유롭게 사용할 수 오픈 소스 분석 소프트웨어를 사용 하는 방법에 반복, 액세스할 수, 재현, 부분적으로 자동화 된 실험 결과 수 있습니다. 또한, 이러한 방법의 제품 잘 서식, 정의 그리고 데이터 분석 소프트웨어, 실험실 내에서 분석 및 실험실 사이 공유 하는 데이터를 완화 하 여 쉽게 이해할 수 있습니다.

우리는 이러한 제품을 생산 하는 데 필요한 단계를 자세히 설명 하는 프로토콜을 제시 포함: 샘플링, 샘플 준비 및 동원 정지 천, 디지털 이미지 수집, 디지털 이미지 분석과 실험 관련 그림 생성의 예는 분석 결과입니다. 우리는 또한이 프로토콜을 지원 하기 위해 오픈 소스 데이터 분석 파이프라인 포함.

Introduction

이 방법의 목적은 특히 활성된 슬러지 flocs 및 에어로빅과 립1 를 포함 하는 생물 반응 기에서 입자의 크기와 모양 분포를 결정 하기 위한 잘 정의 된, 반복, 그리고 부분적으로 자동화 된 방법을 제공 하는 , 2.이 방법은 뒤에 있는 근거 경제성, 단순, 처리량, 향상 하 고 우리의 기존 사내 프로토콜3,4, 반복성, 다른 입자 측정 및 공유를 용이 하 게 하 고 데이터의 비교입니다.

두 개의 광범위 한 카테고리의 입자 측정 분석-산란5같은 자질을 사용 하 여 직접 이미징 및 날개 식 방법 있다. 날개 식 방법과 자동화 될 수 있다 큰 처리량, 비록 장비는 비싸다. 더하여, 날개 식 방법을 정확 하 게 입자6의 동일한 크기를 확인할 수 있습니다, 하는 동안 그들은 제공 하지 않습니다 자세한 모양 정보7.

셰이프 데이터에 대 한 필요 때문에 우리는 기반으로 우리의 방법을 직접 영상. 높은 처리량 이미징 방법 몇 가지 존재 하는 동안 그들은 전통적으로 비싼 상용 하드웨어 또는 사용자 지정 구축된 솔루션8,9를 요구 했다. 우리의 방법은 일반적인, 저렴 한 하드웨어 및 처리량, 감소에서 고통 비록 많은 분석10에 필요한 최소 보다 훨씬 더 많은 입자 이미지를 생성 하는 소프트웨어를 개발 되었습니다.

중요 한 샘플링 및 이미지 수집 단계 기존 프로토콜 지정 하지 않을 수 있습니다. 다른 프로토콜 (예: ad hoc 임계 처리11) 주관적인 편견을 소개 하는 수동 단계를 지정할 수 있습니다. 자유롭게 사용할 수 있는 분석 소프트웨어와 결합 된 샘플링, 동원 정지 및 이미지 수집 단계를 지정 하는 잘 정의 된 메서드는 실험실 내에서 이미지 분석 및 실험실 비교 강화할 것 이다. 이 프로토콜의 주요 목표는 워크플로 및 동일한 샘플에 대 한 다른 실험실에서 재현 가능한 결과를 이끌어야 하는 도구를 제공.

이미지 분석 과정을 정상화, 외 인기 있는 데이터 분석 패키지13,14, 완화 실험이이 파이프라인에 의해 생성 하는 데이터 사용을 위해 적당 한 잘 정의 된, 잘 서식 파일12 에 기록 된 특정 분석 (예: 사용자 지정 그림 세대)와 연구소 간에 공유 촉진 데이터입니다.

이 프로토콜은 특히 입자 모양 데이터, 날개 식 방법에 대 한 액세스를 필요가 없습니다, 그들의 자신의 이미지 분석 파이프라인을 개발 하 고 그들의 데이터를 다른 사용자와 쉽게 공유 하고자 하고자 하지 않습니다 연구자에 대 한 제안

Protocol

1. 입자 분석에 대 한 샘플을 수집 통계 분석10 에 대 한 충분 한 입자를 생산할 예정 이다 특정 원자로 대 한 샘플 볼륨을 결정 (> 500) 입자 중복을 피하고 있는 동안. 혼합된 액의 샘플 당 0.5 ~ 2 mL의 범위는 250와 5000 mg/l. 사이 혼합된 액 일시 중지 고체 (MLSS)와 활성된 슬러지 샘플에 대 한 충분 한 가정 그렇지 않으면, 3 테스트 한 천 배지 0.5, 2, 및 샘플 (2.7 통해…

Representative Results

생성 된 파일그림 1 에 나와 있는 프로세스 분석 이미지 당 두 개의 파일을 생산할 예정 이다. 첫 번째 파일은 쉼표로 구분 된 값 (CSV) 텍스트 파일 개별 입자에 해당 하는 각 행과 열 영역, 순환 성, 견고성 등 다양 한 입자 통계 설명 ImageJ 수동17에 정의 된. 예제 CSV 파일 추가 정보 및 예제/데이터 디렉터리에 포함 됩니…

Discussion

이미지 분석 시스템은 상당히 강력 하 고 불 쌍 한 이미지 제거 되도록 품질 관리 조치는, 비록 샘플링, 접시 준비, 및 이미지 수집에 특정 문제에 적절 한 관심을 향상 시킬 수 모두 데이터의 정확도의 비율 이미지 품질을 전달 합니다.

샘플링 농도
대표 하는 샘플 촬영 되었습니다 가정, 가장 중요 한 단계는 충분 한 입자는 입자 겹치는 그리 집중 하는 동안 대?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 국립 과학 재단 CBET 1336544에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

피지, R 및 파이썬 로고 다음 상표 정책에 따라 사용 됩니다.
파이썬: https://www.python.org/psf/trademarks/
R: https://www.r-project.org/Logo/ 에 나열 된 참조에 의해 SA 4.0 라이센스 당: https://creativecommons.org/Licenses/by-sa/4.0/
피지: https://imagej.net/Licensing

Materials

10% Bleach solution Chlorox 31009 For workspace disinfection.
15 mL centrifuge tube with cap Corning 430790 Per sample.
50 mL Erlenmeyer flask Corning 4980-50 Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing
500 mL Kimax Bottle Kimble-Chase 14395-50 Or otherwise sufficient for agar handling
Agar BD 214010 Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample.
Data analysis software N/A N/A R or Python are suggested
Deionized water N/A N/A Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine.
Desktop computer N/A N/A Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient.
External hard drive Seagate STEB5000100 Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested.
FIJI NIH version 1.51d Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads
GIT Open Source version 2.19.1 or later Available at: https://git-scm.com/
Image capture software ToupView version 3.7.5177 Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data.
Mechanical (X/Y) Stage OMAX A512 Not fully required, but greatly aids image acquisition.
Methylene blue Fisher M291-100 Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample.
Microscope camera OMAX A35140U Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested.
Optical Stage Micrometer OMAX A36CALM1 Or otherwise sufficient for spatial calibration.
Petri dish, 100 mm Fisher FB0875712 1 per sample.
PPE N/A N/A Standard lab coat, gloves, and eyewear.
Sparmoria macro NCSU version 0.2.1 Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis
Stereo/dissecting microscope Nikon SMZ-2T Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD.

Riferimenti

  1. Show, K. Y., Lee, D. J., Tay, J. H. Aerobic granulation: Advances and challenges. Applied Biochemistry and Biotechnology. 167 (6), 1622-1640 (2012).
  2. Adav, S. S., Lee, D. -. J., Show, K. -. Y., Tay, J. -. H. Aerobic granular sludge: Recent advances. Biotechnology Advances. 26 (5), 411-423 (2008).
  3. Initial Investigations of Aerobic Granulation in an Annular Gap Bioreactor. North Carolina State University Available from: https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/2162 (2004)
  4. . Effect of Hydrodynamics on Aerobic Granulation Available from: https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/8761 (2012)
  5. Tay, J. H., Liu, Q. S., Liu, Y. Microscopic observation of aerobic granulation in sequential aerobic sludge blanket reactor. Journal of Applied Microbiology. 91 (1), 168-175 (2001).
  6. Kelly, R. N., et al. Graphical Comparison of Image Analysis and Laser Diffraction Particle Size Analysis Data Obtained From the Measurements of Nonspherical Particle Systems. AAPS Pharm SciTech. 7 (3), E1-E14 (2006).
  7. Walisko, R., et al. The Taming of the Shrew -Controlling the Morphology of Filamentous Eukaryotic and Prokaryotic Microorganisms. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 149, 1-27 (2015).
  8. Campbell, R. A. A., Eifert, R. W., Turner, G. C. Openstage: A Low-Cost Motorized Microscope Stage with Sub-Micron Positioning Accuracy. PLoS ONE. 9 (2), e88977 (2014).
  9. Dias, P. A., et al. Image processing for identification and quantification of filamentous bacteria in in situ acquired images. BioMedical Engineering OnLine. 15 (1), 64 (2016).
  10. Liao, J., Lou, I., de los Reyes, F. L. Relationship of Species-Specific Filament Levels to Filamentous Bulking in Activated Sludge. Applied and Environmental Microbiology. 70 (4), 2420-2428 (2004).
  11. Cromey, D. W. Avoiding twisted pixels: ethical guidelines for the appropriate use and manipulation of scientific digital images. Science and Engineering Ethics. 16 (4), 639-667 (2010).
  12. Wickham, H. Tidy Data. Journal of Statistical Software. 59 (10), (2014).
  13. van Rossum, G. . Python tutorial. , (1995).
  14. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. FIJI: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. . SParMorIA: Sludge Particle Morphological ImageAnalysis Available from: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis (2018)
  16. Ferreira, T., Rasband, W. . ImageJ User Guide: IJ 1.42 r. , (2012).
  17. Sezgin, M., Sankur, B. Survey over image thresholding techniques and quantitative performance evaluation. Journal of Electronic Imaging. 13 (1), 146-166 (2004).
  18. Kröner, S., Doménech Carbó, M. T. Determination of minimum pixel resolution for shape analysis: Proposal of a new data validation method for computerized images. Powder Technology. 245, 297-313 (2013).
  19. McKinney, W. Data Structures for Statistical Computing in Python. Proceedings of the 9th Python in Science Conference. , 51-56 (2010).
  20. Waskom, M., et al. . seaborn: v0.5.0 (November 2014). , (2014).
  21. . dplyr: A Grammar of Data Manipulation Available from: https://cran.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html (2016)
  22. Riley, R. S., Ben-Ezra, J. M., Massey, D., Slyter, R. L., Romagnoli, G. Digital Photography: A Primer for Pathologists. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 18 (2), 91-128 (2004).
  23. Singh, S., Bray, M. A., Jones, T. R., Carpenter, A. E. Pipeline for illumination correction of images for high-throughput microscopy. Journal of Microscopy. 256 (3), 231-236 (2014).
  24. Eastwood, B. S., Childs, E. C. Image Alignment for Multiple Camera High Dynamic Range Microscopy. Proceedings. IEEE Workshop on Applications of Computer Vision. , 225-232 (2012).
  25. High Dynamic Range Microscopy for Cytopathological Cancer Diagnosis. IEEE Journal of Selected Topics in Signal Processing (Special Issue on: Digital Image Processing Techniques for Oncology) Available from: https://www.lfb.rwth-aachen.de/en/ (2009)
  26. Jain, V., et al. Supervised Learning of Image Restoration with Convolutional Networks. 2007 IEEE 11th International Conference on Computer Vision. , 1-8 (2007).

Play Video

Citazione di questo articolo
Weaver, J. E., Williams, J. C., Ducoste, J. J., de los Reyes III, F. L. Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline. J. Vis. Exp. (143), e58963, doi:10.3791/58963 (2019).

View Video