オープン ソース ソフトウェア パイプラインによる寒天培地に固定化活性汚泥粒子径・形状を測定
Summary
サイズと活性汚泥粒子の形状は、さまざまな方法を用いて測定される重要なパラメーターです。代表でないサンプリング、最適イメージ、および主観的な解析パラメーターの不確かさが生じる。これらのエラーを最小限に抑えるため、測定を容易にするオープン ソース ソフトウェア パイプラインを含むすべての手順を指定するプロトコルを提案します。
Abstract
それらの治療の排水などの実験的バイオリアクターには、粒子サイズと形状は、重要なパラメーターにはが含まれています。たとえば、サイズおよび活性汚泥フロックの形、マイクロ スケールでの条件が指定でき、浄水汚泥のどれだけ定着にも直接影響します。
粒子のサイズと形状は、両方の ‘シンプルな’ 誤解の測定値です。多くの微妙な問題、頻繁に非公式なプロトコルと放置は、サンプリング、イメージング、および粒子を分析するときに発生します。サンプリング メソッドは、バイアスされることがあります。 または統計的十分な電力が供給されません。サンプルそのものでは不十分な維持可能性があります。 または固定中に変更を受けます。十分な品質のイメージができない場合があります。重なり合った粒子像、被写し界深度、倍率、様々 な騒音がすべて悪い結果を生みます。不十分な指定された分析は、手動閾値処理と領域分割によって生成されるよう、バイアスを導入できます。
手頃な価格とスループットが再現性と望ましいです。手頃な価格、高スループット方法がより頻繁に粒子計測、粒子の数千人を含む多くの画像を生成できます。安価な試薬、共通の解剖顕微鏡および自由に利用できるオープン ソースの解析ソフトウェアを使用するメソッドでは、反復可能なアクセス可能な再現できる、部分的に自動化の実験結果をことができます。さらに、このようなメソッドの製品は整形済み、ラボ内で解析と実験室間のデータ共有の両方を緩和、データ分析ソフトウェアで容易に理解できる、明確に定義をすることができます。
このような製品を生産するために必要な手順を詳しく説明するプロトコルを提案するなど: サンプリング, 試料調製及び寒天、デジタル画像集録、デジタル画像解析および実験固有図生成の例で固定、分析結果。我々 はまた、このプロトコルをサポートするオープン ソースのデータ解析パイプラインを含まれています。
Introduction
このメソッドの目的は、バイオリアクター、活性汚泥フロックと好気性顆粒1を含む特にそれらの粒子のサイズと形状の分布を決定する明確で反復利用と部分的に自動化された方法を提供するには,2この方法の後ろの理論的根拠は、手頃な価格、シンプルさ、スループットを高めると、既存社内プロトコルの3、4、再現性、他の粒子計測を容易にし共有を容易にすると。データの比較。
粒子測定分析 – の 2 つの広範なカテゴリ、光散乱5としてそのような資質を使用して直接撮像および推論の方法があります。推論方法を自動化し、スループットが大きく、装置は高価です。さらに、推論方法は粒子6の同等のサイズを正確に判断できます中、に、彼らは、形状詳細情報7を行いません。
図形データのための必要性、我々 は直接画像に本手法を基づいています。いくつかの高速イメージング メソッドが存在する場合、高価な商用ハードウェアまたはカスタム ビルド ソリューション8,9が伝統的に彼ら必要。一般的な手頃な価格のハードウェアと、スループットの低下に苦しんでいるが多くの分析10に必要な最小値よりもはるかに多くの粒子画像を生成するソフトウェアを採用する私たちの法を開発しました。
既存のプロトコルでは、重要なサンプリングおよび画像取得手順を指定できません。他のプロトコルは、(アドホック閾値11) などの主観的なバイアスを導入する手動の手順を指定できます。自由に利用できる解析ソフトウェアと組み合わせてサンプリング、固定化、イメージの取得手順を指定する明確に定義されたメソッドには、ラボ内で画像解析と実験室間の比較を強化します。このプロトコルの主要な目的は、ワークフローと同じサンプルの別の研究室から再現可能な結果につながる必要がありますツールを提供することです。
画像解析処理を正規化し、離れて使用に適した明確に定義された、適切にフォーマットされたファイル12にこのパイプラインで生成されるデータを記録人気データ分析パッケージ13,で14実験を緩和(カスタム図生成) などの特定の分析と実験室間の共有促進のデータ。
このプロトコルは、粒子形状データを必要とする、推論のメソッドへのアクセスを持っていない、独自の画像解析パイプラインを開発し、他のユーザーとデータを簡単に共有したいしたくない人のため特に勧め
Protocol
Representative Results
Discussion
画像解析システムはかなり堅牢な QC の手続きして、悪いイメージを削除、サンプリング、プレートの準備、および画像の取得の固有の問題に適切な注意ができる両方のデータの精度との割合品質管理を通過した画像。
サンプル濃度
代表的なサンプルを撮影されていると仮定すると、最も重要なステップは、十分な粒子が粒子が重なってないので集中し、?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は国立科学財団のあわせて用いるもの 1336544 からの助成金によって支えられました。
フィジー、R、および Python のロゴは、以下の商標ポリシーとの調和で使用されます。
Python: https://www.python.org/psf/trademarks/
R: https://www.r-project.org/Logo/に記載されている CC SA 4.0 ライセンスに従って: https://creativecommons.org/Licenses/by-sa/4.0/
フィジー: https://imagej.net/Licensing
Materials
| 10% Bleach solution | Chlorox | 31009 | For workspace disinfection. |
| 15 mL centrifuge tube with cap | Corning | 430790 | Per sample. |
| 50 mL Erlenmeyer flask | Corning | 4980-50 | Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing |
| 500 mL Kimax Bottle | Kimble-Chase | 14395-50 | Or otherwise sufficient for agar handling |
| Agar | BD | 214010 | Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample. |
| Data analysis software | N/A | N/A | R or Python are suggested |
| Deionized water | N/A | N/A | Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine. |
| Desktop computer | N/A | N/A | Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient. |
| External hard drive | Seagate | STEB5000100 | Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested. |
| FIJI | NIH | version 1.51d | Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
| GIT | Open Source | version 2.19.1 or later | Available at: https://git-scm.com/ |
| Image capture software | ToupView | version 3.7.5177 | Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data. |
| Mechanical (X/Y) Stage | OMAX | A512 | Not fully required, but greatly aids image acquisition. |
| Methylene blue | Fisher | M291-100 | Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample. |
| Microscope camera | OMAX | A35140U | Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested. |
| Optical Stage Micrometer | OMAX | A36CALM1 | Or otherwise sufficient for spatial calibration. |
| Petri dish, 100 mm | Fisher | FB0875712 | 1 per sample. |
| PPE | N/A | N/A | Standard lab coat, gloves, and eyewear. |
| Sparmoria macro | NCSU | version 0.2.1 | Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis |
| Stereo/dissecting microscope | Nikon | SMZ-2T | Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD. |
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