Yüksek kaliteli lazer RNA izolasyonu için paslanmaz bir protokol yakalama insan öldükten sonra beyincik Microdissected Purkinje hücreleri

Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) sonraki tatlı tahrik değerlendirme için patolojik olarak ilgili hücreleri ayırma verir bir değerli araştırma aracıdır. Moleküler analiz bu türdeş olmayan doku örnekleri ve korelasyon patolojik ve klinik verilerle biyolojik araştırma¹translasyonel önemini değerlendirmek gerekli bir adım kullanmaktır. Gen ifadesi verileri RNA üzerinden analiz ederken, donmuş doku bölümleri kullanımını RNA mükemmel kalitesi için verdiğinden önerilir yanı sıra miktar²ekranı kaplamış. Evet yüksek kalite ve RNA miktarı RNA sıralama³den anlamlı veriler için gerekli olan kurulmuştur. Ancak, RNA LCM için taze donmuş post-mortem doku kullanırken, RNA bozulması büyük bir sorun, ölümü üzerine hemen gerçekleşir ve ölçüde kendi doku toplama Yöntem⁴ile^{,5 ilişkili çeşitli faktörler tarafından aracılık ettiği gibi olduğunu} . Ayrıca, boyama teknikleri histolojik ayrıntıları ve hücre kimliğini tanımak için gerektiğinde RNA bozulması şiddetlenir. Hematoksilen ve eozin, Nisl leke gibi teknikleri boyama İhtisas ayirt ve immünhistokimya çevreleyen stroma hücreleri ayırt yararlı ama RNA aşağılamak ve transkript ifade değiştirmek için gösterilen profilleri⁶. Bu nedenle, bizim laboratuvar RNA öldükten sonra insan beyincik LCM yalıtım Purkinje nöronların sonra RNA sıralama amaçları için korumak için özel olarak tasarlanmış bir paslanmaz protokol yarattı.

Taze donmuş doku LCM için işleme, fiksasyon yöntemi degisken RNA ve doku bütünlüğü etkileyebilir. Formalin fiksasyon morfolojik korunması için standart, ancak bu cross-linking nedenleri RNA parçası ve RNA amplifikasyon⁷ile müdahale. ¹cross-linking teşvik değil koagülatif bir sabitleştirici olarak etanol fiksasyon RNA izolasyonu için daha iyi bir alternatiftir. Lipidler dokudan kaldırır gibi doku morfoloji görselleştirme, ksilen en iyi seçenek, artırmaktır. Ancak, orada sınırlamalar ne zaman belgili tanımlık doku kurumasına ve kırılgan neden doku parçalanma üzerine lazer yakalama⁷haline LCM, ksilen kullanan denir. Ksilen da uçucu bir toksin ve düzgün bir duman mahallede ele alınması gerekir. Yine de, ksilen doku görselleştirme Ayrıca RNA bütünlük⁸koruma sırasında artırmak için gösterilmiştir. Bu nedenle, bizim iletişim kuralı kullanımı % 70 etanol fiksasyon ve etanol dehidratasyon, ksilen kuluçka morfolojik netlik için ardından etrafında merkezleri.

Onlar hızlı, hassas ve RNA kalite farklı gösterildiği gibi farklı türde mikrodiseksiyon lazer tabanlı sistemleri, unutmamak önemlidir. Kızılötesi (IR) lazer yakalama mikrodiseksiyon ve ultraviyole (UV) lazer microbeam mikrodiseksiyon sistemleri neredeyse aynı anda⁸ortaya her iki roman LCM platform olduğunu. IR-LCM sistem “doğrudan doku bölümüne yerleştirilen bir şeffaf termoplastik film kullanarak bir iletişim sistemi” istihdam ve ilgi hücreleri seçerek film tarafından odaklı bakliyat bir IR Lazer uygun. Alternatif olarak, UV-LCM sistemidir “bir temassız sistem sayede odaklı lazer ışını uzakta hücreleri ya da doku; ilgi bölgelerinde keser” bir ters veya dik mikroskop tasarımı kullanma iki mevcut ticari platformlarda yapılandırmasına doku içine bir koleksiyon aygıt yerçekimine karşı mancınık bir lazer kaynaklı basınç dalgası tarafından kazanılır veya doku sırasıyla yerçekimi tarafından toplanan. UV-LCM sisteminin önemli avantajı daha hızlı hücre satın alma, temassız yaklaşım ve daha kesin diseksiyon nedeniyle bir çok küçük lazer ışın çapı⁹ile kirlenme ücretsiz toplama içerir. Bu iletişim kuralı bir UV-LCM sistemi için özel olarak tasarlanmıştır ve bir IR-LCM sisteminde test edilmemiştir. Koleksiyon kap içine biriken hücreler, bir coverslip kullanımını artırır hücreleri toplama kap girmek mümkün olacak gibi ya da UV-LCM sistem tasarımı, hücresel netlik mikroskobu sırasında uygun, değildir. Bu nedenle, doku görselleştirme geliştirmek için karşı sıvı dolgulu koleksiyonu kapaklar UV-LCM sistemlerindeki mikroskobik görüntüleme için bir coverslip olarak hareket için tasarlanmıştır opak koleksiyonu büyük harf kullanımını test ettik. Sıvı buharlaşma tabidir ve mikroskop çalışırken sık sık değiştirilmesi gerekir gibi sıvı dolgulu koleksiyonu kapaklar, zor olabilir. Yakalanan doku hemen⁷çözülür gibi zaman RNA istikrar için önemli bir faktör haline gelir.

Beyincik esansiyel tremor (ET) hastalarda ve beyincik ilgili nörodejeneratif bozuklukları öldükten sonra neuropathologic değişimler bizim laboratuvar çalışmaları. Biz morfolojik değişiklikler ET durumlarda denetimleri, Purkinje hücreleri, azaltılmış bir dizi de dahil olmak üzere karşı ayırt Purkinje hücreleri merkezli arttı dendritik regresyon ve çeşitli aksonal değişikliklere, bize önermeyi önde gelen göstermiştir bu Purkinje hücre dejenerasyonu çekirdek biyolojik ET Patogenez^10,11,12,13özelliğidir. Transkripsiyon profil oluşturma birçok nörolojik hastalıklarda dejeneratif hücresel değişiklikler temel alınan moleküler temeli keşfetmek için kullanılmıştır. Ancak, beyin doku bölgeleri gibi heterojen örnekleri transkripsiyon profillerden effectually düşük bereket transkript ifade maske ve/veya etkilenen, sadece küçük bir nüfus içinde moleküler değişiklikler tespiti azaltmak serebellar korteksin Purkinje hücreleri gibi hücrelerin. Örneğin, Purkinje hücreleri büyük ölçüde serebellar korteksin bol granül hücrelerde tarafından yaklaşık 1:3000 tarafından sayıca; Böylece, etkili bir şekilde hedef için onların transcriptome bu nöronların belirli yalıtımı gerektirir. Serebellar korteksin farklı hücre yoğunluğu ve hücre boyutu farklı katmanları tarafından belirlendi. Bu hücresel mimarisi boyama reaktif boya içeren olmadan taze donmuş doku örneği görselleştirmek idealdir. Teorik olarak, bu iletişim kuralını da benzer farklı doku var diğer doku türlerine uygulanabilir organizasyon.

Bu protokol insan öldükten sonra beyincik Purkinje hücre görselleştirme için özel olarak çalışmak üzere tasarlanmıştır. Görselleştirme ve dokuların birçok türde RNA koruma, her iki IR – ve UV-LCM amaçlı boyama fiksasyon için çok sayıda protokoller bulunmaktadır. Ne zaman UV-LCM için deneysel bir tasarım düşünürken, bireylerin ihtiyaçları ve başlangıç ve bitiş malzeme gereksinimlerini en iyi sığacak şekilde onların Protokolü terzi. Burada, biz öldükten sonra insan beyincik boya boyama reaktifler içeren yüksek kaliteli RNA transcriptome için hazırlamak gerek kalmadan Purkinje hücreleri görüntülenmesi için geliştirilmiş bir yöntem sağlamak için farklı LCM iletişim kuralları, bir çok yönünü birleştirmek sıralama.