Um protocolo de aço inoxidável para isolamento de RNA de alta qualidade do Laser capturar células de Microdissected Purkinje no cerebelo humano Post Mortem

Do laser captura microdissection (LCM) é uma ferramenta valiosa pesquisa que permite a separação das células patologicamente relevantes para posterior avaliação molecularmente orientada. O uso de análises moleculares nestes espécimes de tecido heterogêneo e a correlação com dados clínicos e patológicos é um passo necessário na avaliação o significado translacional de pesquisa biológica¹. Ao analisar dados da expressão do gene do RNA, o uso de seções do tecido congelado é altamente recomendado pois permite excelente qualidade de RNA bem como maximizada quantidade². Tem sido bem estabelecida que alta qualidade e a quantidade de RNA são essenciais para dados significativos de sequenciamento de RNA³. No entanto, quando usando o RNA do tecido fresco congelado post-mortem para LCM, degradação de RNA é um grande desafio, como ocorre imediatamente após a morte e sua extensão é mediada por diversos fatores associados com o tecido coleção método^4,5 . Além disso, degradação de RNA é agravada quando as técnicas de coloração são necessários para reconhecer detalhes histológicos e identificação de célula. Especializou-se de técnicas, como a hematoxilina & eosina, Nissl mancha, de coloração imunofluorescência e imunohistoquímica são úteis na diferenciação de células do estroma circundante, mas têm sido mostrados para degradar o RNA e alterar a expressão de transcrição perfis de⁶. Portanto, nosso laboratório criou um protocolo inoxidável projetado especificamente para preservar o RNA no cerebelo humano post mortem para fins de sequenciação do ARN, após isolamento de LCM de neurônios de Purkinje.

No processamento de tecido congelado fresco para o LCM, o método de fixação variàvel pode afetar a integridade tanto do RNA e tecido. Fixação de formalina é padrão para preservação morfológica, mas causas do cross-linking que podem fragmentar o RNA e interferir de amplificação do RNA⁷. Fixação de etanol é uma alternativa melhor para o isolamento de RNA, como é um hemostático fixador que não induz a do cross-linking¹. Para melhorar a visualização da morfologia do tecido, xileno é a melhor escolha, como ele remove lipídios do tecido. No entanto, existem conhecidas limitações quando utilizando o xileno no LCM, como os tecidos podem secar e tornar-se frágil causando fragmentação de tecido em cima do laser captura⁷. Xileno também é uma toxina volátil e deve ser manuseado corretamente em uma coifa. Não obstante, xileno foi mostrado para melhorar a visualização do tecido preservando também RNA integridade⁸. Portanto, nosso protocolo centros em torno do uso de fixação de etanol 70% e desidratação do etanol, seguido de incubação xileno para clareza morfológica.

É importante observar os diferentes tipos de sistemas baseados em laser microdissection, como eles têm sido mostrados para diferem em velocidade, precisão e qualidade do RNA. O laser de infravermelho (IR) capturar microdissection e os sistemas de microdissection microbeam de laser ultravioletas (UV) foram as duas plataformas de LCM romance que surgiu quase simultaneamente⁸. O sistema IR-LCM emprega um sistema de”contacto” usando um filme termoplástico transparente colocado diretamente na seção de tecido, e as células de interesse seletivamente aderirem ao filme por pulsos de concentrado de um laser de IR. Alternativamente, o UV-LCM é um sistema “non-contact” no qual um feixe de laser focalizado corta fora as células ou regiões de interesse no tecido; dependendo da configuração em duas plataformas comerciais atualmente disponíveis que usam qualquer um microscópio invertido ou vertical design, tecido é adquirido em um dispositivo de recolha por uma onda de pressão induzida por laser que catapulta-lo contra a gravidade ou tecido é coletados por gravidade, respectivamente. Vantagens significativas do sistema UV-LCM incluem aquisição de celular mais rápida, coleção livre de contaminação com a abordagem de não-contato e dissecação mais precisa devido a um muito menor laser feixe diâmetro⁹. Este protocolo foi projetado especificamente para um sistema de UV-LCM e não foi testado em um sistema de IR-LCM. Em qualquer projeto de sistema de UV-LCM, quando acumuladas células na PAC coleção, o uso de uma lamela que aumenta a clareza celular durante a microscopia não é apropriada, como as células seriam incapazes de entrar o cap de coleção. Portanto, para melhorar a visualização do tecido, testamos o uso de tampões de coleção opaco, que são projetados para agir como uma lamela para visualização microscópica em sistemas UV-LCM, contra tampões coleção cheia de líquido. Tampões de coleção cheia de líquido podem ser um desafio, como o líquido está sujeito a evaporação e deve ser substituído frequentemente enquanto estiver trabalhando no microscópio. Tempo torna-se um fator importante para a estabilidade do RNA, como o tecido capturado imediatamente dissolve⁷.

Nosso laboratório estuda as alterações post-mortem de contrair no cerebelo dos pacientes com tremor essencial (ET) e doenças neurodegenerativas relacionadas do cerebelo. Temos demonstrado alterações morfológicas centradas nas células de Purkinje que distinguem ET casos versus controles, incluindo um número reduzido de células de Purkinje, aumentaram dendrítica regressão e uma variedade de alterações axonal, levando-na postular que Purkinje degeneração celular é um recurso biológico núcleo ET patogênese^10,11,12,13. Perfil transcricional serviu em muitas doenças neurológicas para explorar a base molecular subjacente de alterações degenerativas do celulares. No entanto, perfis transcriptional de amostras heterogêneas, como regiões de tecido do cérebro, podem efetivamente mascarar a expressão de transcritos de baixa abundância e/ou diminuir a detecção de alterações moleculares que ocorrem apenas em uma pequena população de afetados células, como células de Purkinje do córtex cerebelar. Por exemplo, células de Purkinje são vastamente em desvantagem pelas células grânulo abundantes no córtex cerebelar por aproximadamente 1:3000; assim, para efetivamente alvo seu transcriptome exige isolamento específico destes neurônios. O córtex cerebelar é delineado por camadas distintas que diferem em densidade celular e tamanho da célula. Essa arquitetura celular é ideal para visualizar em uma amostra de tecido fresco congelado sem tintura contendo reagentes de coloração. Em teoria, este protocolo também poderia ser aplicado a outros tipos de tecidos que têm tecido característico semelhante organização.

Este protocolo foi projetado para trabalhar especificamente para visualização de células de Purkinje no cerebelo humano post mortem. Inúmeros protocolos existem para a fixação, de coloração, para efeitos de ambos os IR – e UV-LCM, visualização e preservação de RNA de muitos tipos de tecidos. Quando contemplando um projeto experimental para UV-LCM, indivíduos devem adaptar seu protocolo para melhor atender as necessidades e requisitos da inicial e final de materiais. Aqui, nós combinamos muitos aspectos dos diferentes protocolos de LCM para fornecer um método aprimorado para a visualização de células de Purkinje no cerebelo humano sem a necessidade de corante contendo reagentes coloração para preparar RNA de alta qualidade para transcriptome post-mortem sequenciamento.