레이저에서 고품질 RNA 격리 스테인리스 프로토콜 캡처 Microdissected Purkinje 세포 인간의 사후 소 뇌에

레이저 캡처 기정 (LCM)는 후속 분자로 제어 평가 대 한 병 적 관련 세포의 분리 수 있습니다 귀중 한 연구 도구입니다. 이러한 다른 유형의 조직 표본 및 병리학 및 임상 데이터와 상관 관계에 분자 분석의 사용 생물 학적 연구¹의 변환의 평가에 필요한 단계입니다. RNA 유전자 표현 데이터를 분석할 때 언된 조직 단면도의 사용이 좋습니다 RNA의 우수한 품질에 대 한 수 뿐 아니라 수량²최대화. 그것은 잘 설립 되었습니다 높은 품질과 수량 RNA의 RNA 시퀀싱³에서 의미 있는 데이터에 대 한 필수적입니다. 그러나, LCM에 대 한 신선한 냉동된 사후 조직에서 RNA를 사용 하 여 때 RNA 강 직은 주요 도전, 죽음에 즉시 발생 하 고 그 범위는 조직의 컬렉션 방법^{4,5와 관련 된 다양 한 요인에 의해 중재} . 또한, RNA 저하 얼룩 기법 인식 더 세부 사항 및 셀 식별 하는 데 필요한 때 악화 됩니다. 전문 기술 되며 & 오신, Nissl 얼룩, 얼룩 면역 형광 및 immunohistochemistry 주변 기질에서 세포를 차별화 하는 데 도움이 하지만 RNA 저하 고 사본 식 변경 표시 되었습니다. 프로필⁶. 따라서, 우리의 실험실 스테인리스 프로토콜 Purkinje 신경의 LCM 격리 후 RNA 시퀀싱의 목적에 대 한 사후 인간 소 뇌에 RNA를 보존 하기 위해 특별히 만들었습니다.

LCM에 대 한 신선한 냉동된 조직 처리, 고정 방법 변함없이 RNA와 조직의 무결성을 발생할 수 있습니다. 포 르 말린 고정 형태 보존을 위한 표준 이지만 원인 있는 cross-linking RNA 수 있습니다 그리고 RNA 증폭⁷방해. 그것은 상호¹을 유도 하지 않는 coagulative 정착 액 에탄올 고정 RNA 격리에 대 한 더 나은 대안입니다. 조직 형태학의 시각화를 향상 시키기 위해, 크 실 렌은 조직에서 지질 제거로 최고의 선택 이다. 그러나, 조직 수 밖으로 건조 하 고 레이저 캡처⁷시 취 일으키는 조직 조각화 되 LCM, 자일 렌을 활용 하면 제한 알려져 있습니다. 크 실 렌은 또한 휘발성 독 소 하 고 증기 두건에서 제대로 처리 되어야 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 크 실 렌은 또한 RNA 무결성⁸을 유지 하면서 조직 시각화를 향상을 보였다. 따라서, 우리의 프로토콜 70% 에탄올 고정 및 에탄올 탈수, 크 실 렌 외피 형태학 선명도 대 한 다음의 사용 주위 센터.

그것은 그들은 속도, 정밀도, 및 RNA 품질 표시 되었습니다로 서 레이저 기반 시스템의 종류를 주의 하는 것이 중요. 적외선 (IR) 레이저 캡쳐 서 자외선 (UV) 레이저 microbeam 기정 시스템⁸을 거의 동시에 등장 하는 두 소설 LCM 플랫폼을 했다. IR-LCM 시스템 사용 조직 섹션에 투명 열가 소성 필름을 사용 하 여 “연락처 시스템” 그리고 관심사의 세포 선택적으로 준수 영화 집중된 펄스에 의해 IR 레이저에서. 또는, UV LCM 시스템은 세포 또는 조직;에 대 한 관심의 영역이 그것에 의하여 초점된 레이저 빔을 멀리 인하 “비 접촉 시스템” 거꾸로 또는 똑바로 현미경 디자인 중 하나를 사용 하는 두 현재 사용 가능한 상용 플랫폼에서 구성에 따라 조직 중력에 대 한 투 석기는 레이저 유도 압력 파에 의해 수집 장치로 인수 또는 조직 중력에 의해 각각 수집. UV LCM 시스템의 중요 한 장점 빠른 세포 수집, 비 접촉 방식 및 많은 더 작은 레이저 빔 직경⁹인 더 정확한 해 부 오염 무료 컬렉션을 포함합니다. 이 프로토콜은 UV LCM 시스템을 위해 설계 된 고 IR LCM 시스템에서 테스트 되지 않았습니다. 어느 UV LCM 시스템 설계에 컬렉션 모자에 축적 셀는 coverslip의 사용을 향상 하는 때 현미경 중 세포 선명도가 아니다 적합, 셀 컬렉션 모자에 입력 수 없습니다. 따라서, 조직 시각화를 향상 시키기 위해, 액체 채워진된 컬렉션 모자에 대 한 UV LCM 시스템에 미세한 시각화 coverslip로 행동 하도록 설계 된 불투명 컬렉션 모자를 사용 하 여 테스트 했습니다. 액체는 증발 하 고 현미경에서 작업 하는 동안 자주 교체 해야 합니다 액체 채워진된 컬렉션 모자, 도전적 일 수 있다. 캡처된 조직을 녹이 고 즉시⁷시간 RNA 안정성에 대 한 중요 한 요소가 된다.

우리의 실험실 연구 진전 (동부)을 가진 환자의 소 뇌 및 소 뇌의 신경 관련된 질환에 사후 neuropathologic 변경 합니다. 우리는 시연 대 컨트롤, Purkinje 세포의 감소 된 수를 포함 하 여 동부 표준시 경우를 구별 하는 Purkinje 셀에 중심 형태 론 적 변화 증가 수지상 회귀 및 axonal 변화의 다양 한 공준을 선도 그 Purkinje 세포 변성은 외 병^10,11,,1213에 핵심 생물 학적 기능입니다. Transcriptional 프로 파일링은 세포 퇴행 성 변화의 기본 분자 단위로 탐구에 많은 신경학 상 질병에 사용 되었습니다. 그러나, 뇌 조직 영역 같은 다른 유형의 샘플에서 transcriptional 프로필 수 effectually 낮은 풍부 성적 표현의 마스크 또는 감소의 영향을 받는 작은 인구에서 서만 발생 하는 분자 변화 감지 소 뇌 피 질에서 Purkinje 세포와 같은 세포. 예를 들어, Purkinje 세포는 훨씬 숫 적 소 뇌 피 질에 풍부한과 립 세포에 의해 약 1:3000; 따라서, 효과적으로 대상에 자신의 transcriptome 이러한 뉴런의 특정 격리가 필요합니다. 소 뇌 피 질 세포 밀도 및 셀 크기 고유 층에 의해 구분 된입니다. 이 세포질 건축 착 색 시 약 염료를 포함 하지 않고 신선한 냉동 조직 샘플에서 시각화 이상적입니다. 이론적으로,이 프로토콜 또한에 적용할 수 있는 비슷한 독특한 조직 다른 조직 유형 조직.

이 프로토콜은 인간의 사후 소 뇌의 Purkinje 세포 시각화를 위해 특별히 작동 하도록 설계 되었습니다. 수많은 프로토콜 고정, 시각화 및 조직의 많은 종류의 RNA 보존 목적의 두 IR-와 UV-LCM에 대 한 얼룩을 위한 존재 한다. UV LCM에 대 한 실험 설계를 고민 하는 경우 개인 필요와 시작 및 끝 재료의 요구 사항에 가장 적합 하 그들의 프로토콜에 맞게 해야 합니다. 여기, 우리가 transcriptome 수준 높은 RNA 준비 착 색 시 약을 포함 하는 염료의 필요 없이 사후 인간의 뇌에서 Purkinje 세포를 시각화에 대 한 향상 된 방법을 제공 하기 위해 다른 LCM 프로토콜의 여러 측면을 결합 시퀀싱.