介绍了从自动微生物反应器的收获细胞培养液(HCCF)中分离和后续分析的单克隆抗体的详细方案。还介绍了使用分析来确定关键质量属性 (CQA) 和最大化有限样本量以提取重要信息。
单克隆抗体(mAbs)是当今生产的最受欢迎和最具特征的生物产品之一。最常用的使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,培养和工艺条件必须优化,以最大限度地提高抗体定位剂,并实现目标质量配置文件。通常,此优化使用自动微尺度生物反应器 (15 mL) 并行筛选多个工艺条件。优化标准包括培养性能和单克隆抗体(mAb)产品的关键质量属性(CQA),这可能会影响其有效性和安全性。培养性能指标包括细胞生长和营养消耗,而CQA包括mAb的N-糖基化和聚合谱、电荷变异和分子量。此详细协议描述了如何纯化并随后分析由自动化微生物反应器系统生成的 HCCF 样品,以获得宝贵的性能指标和输出。首先,采用自动蛋白快速蛋白液相色谱(FPLC)方法从收获的细胞培养样品中纯化mAb。浓缩后,使用特定平台通过质谱法分析甘油轮廓(参见材料表)。抗体分子量和聚合谱使用尺寸排除色谱-多角度光散射(SEC-MALS)确定,而电荷变型则使用微芯片毛细管区电泳(mCZE)进行分析。除了在生物反应器过程中捕获的培养性能指标(即培养活力、细胞计数和常见的代谢物(包括谷氨胺、葡萄糖、乳酸和氨)外,还分析废培养基,以确定将营养物质限制在改进进给策略和整体工艺设计。因此,还介绍了通过废介质的液相色谱-质谱法(LC-MS)对氨基酸进行绝对定量的详细方案。该协议中使用的方法利用了与大量小容量样本兼容的高吞吐量平台。
蛋白质疗法正被用来治疗越来越多的医疗条件,包括组织移植并发症,自身免疫性疾病和癌症1。自 2004 年以来,美国食品和药物管理局 (USFDA) 记录的生物许可申请 (BLA) 中,药物评估和研究中心 (CDER) 监管的所有审批中的比例不断增加,其中 BLA 占 25% 以上2014年和2015年2.
考虑到这一不断扩大的市场,生物制药制造商面临着快速提供更多具有一致质量的产品的挑战。提高产品产量的努力集中在CHO细胞工程和生产线筛选上,尽管最显著的改进是由于介质/饲料策略优化和细胞培养环境控制的进步1,3,4,5在制造过程中。
由于mAbs是在生物系统中产生的,因此可能有固有的蛋白质变异性。抗体成分可以在翻译后改变,如糖基化或受降解或酶反应的影响。这些结构变异可能引起危险的免疫反应或改变抗体结合,这反过来又可以减少或消除预期的治疗功能5。因此,单克隆抗体的关键质量属性 (CQA) – N-甘油轮廓、电荷变异分布和单体形式的抗体百分比 – 在制造工艺1,6.在受监管的生产环境中,治疗蛋白必须符合验收标准才能被许可为经批准的商业药品7。本文介绍的方法通常是抗体7、8的质量表征过程的一部分,任何蛋白质科学家都会熟悉它们的用法。
在前期工作9中,介绍了微生物反应器在上游生物处理中用于高通量细胞培养条件筛选的应用和运行。从不同介质条件获得的纯化产物使用LC-MS进行N-甘油分析。各种甘油物种的存在与生物过程参数有关,如饲料策略、pH和温度12。不同的介质条件对产品质量的影响,以单体形式的IgG百分比表示,也通过尺寸排除色谱-多角度光散射(SEC-MALS)13、14进行评价,15.电荷变型配置文件表示一些可能影响产品功能的修改16。微毛细管区电泳 (mCZE) 是一种技术,与传统阳离子交换 (CEX) 色谱和毛细等电对焦 (cIEF) 方法相比,可提供更快的分析时间17 ,18.对废生物反应器介质进行了分析,以跟踪蛋白质生产过程中的氨基酸消耗,因为它与抗体识别属性的变化有关19、20、21、22 ,23.
蛋白质分析使我们能够根据工艺输入和CQA变化之间的关系来识别关键工艺参数(CPP)。在生物工艺开发过程中,识别和测量 CPP 从根本上证明了过程控制,并确保产品没有变化,这在高度规范的制造环境中至关重要。本文介绍了一些与产品CQA最相关的蛋白质的生化特性(N-甘油轮廓、电荷变型和大小均质)的分析技术。
HCCF 含有碎屑和大颗粒,这些碎片和大颗粒会堵塞和破坏昂贵的仪器,因此在进一步下游处理之前需要澄清培养物。离心通常是首先将细胞和其他不溶性颗粒从蛋白质中分离出来,然后是过滤。然后,通过快速蛋白液相色谱(FPLC)进行纯化。从自动微生物反应器中纯化HCCF以获得产品是下游加工的重要一步。在这里,一个具有蛋白质A柱的台式FPLC系统用于从HCCF获得单克隆抗体。上游过程分析可以提供对细胞行为的有用洞察,并指导生物工艺设计,帮助获得一致可靠的优质产品。分析还允许将关键质量属性 (CQA) 链接到上游和下游流程。这里介绍的四种检测,通常用于单克隆抗体的表征。这些技术是健壮的,可靠的,易于部署从各种上游来源的过程和产品分析,只有部分纯化,可能仍然含有残留水平的DNA和HCP。
在清理样品进行分析时,必须在创建足够清洁的样品和保留生物反应器中存在的可变性之间取得重要平衡。影响产品最常见的两种污染物是DNA和HCP,可以通过测量260/280 nm的阻尼率和通过SDS-PAGE或_CE-SDS来检查。此处提供的测定对低DNA含量不敏感。产品的纯度为>95%纯,由_CE-SDS决定。
使用微毛细血管电泳系统的电荷变型分析提供了一种高通量方法,用于识别电荷变型,芯片和试剂相对容易实现。该技术的性质和标签试剂的化学性质对赋形剂和其他原发性胺都敏感,因此大多数样品基质都需要脱盐步骤。根据经验,低水平的DNA与标签反应的自由染料共同迁移,不影响结果的质量。虽然基本、主峰和酸性峰定量的变异性通常为<1%,但较高的DNA和其他污染物水平可以增加测定的变异性。与蛋白质标签保持一致,并确保在从瓶子中取出并与染料混合后迅速使用 DMF,这一点非常重要。推荐使用氨酸和/或组氨酸标准作为标签控制。随着时间的推移,根据样品质量,芯片可能会污染或失去微流体通道上的涂层,导致更大的噪声、鬼峰的存在以及更大的样品对样品变化。为了识别这种情况,空白和系统适用性标准(即 NISTmAb)与样本同时定期进行分析。当出现芯片问题时,可以使用存储解决方案清洗或更换芯片。
治疗性糖蛋白的甘油分析方法主要涉及液相色谱(LC)和/或质谱法(MS),其中叶酸微阵列分析作为第三个选项25越来越受欢迎。本文描述的方法同时使用LC和MS,这有其优点和缺点。质谱方法具有对分析的甘油进行质量验证的优势,使用荧光检测输出或叶酸微阵列的基于 LC 的方法是不可能的。此方法使用 LC 和荧光检测,使用与 dextran 梯形标准相比,使用保留时间来分配甘油标识。荧光监测允许提高灵敏度和定量,由于其检测的方便性,由于寡糖的电位效率差,仅MS就可能无法量化低丰度物种。来自 MS 的质量信息用于确认甘油标识,但处理软件不使用质量信息作为主要分配条件。因此,如果没有可重复的色谱和易于解决的峰值,这种方法可能会遭受甘油分配的影响。幸运的是,即使在色谱低于标准的情况下,质量信息也能帮助进行甘油分配,例如,在保留时间上发生偏移,妨碍可重复的甘油分配。如果在没有 MS 的情况下使用此方法,色谱必须处于最高水平,因为质量信息不能用于校正停留时间漂移。
本文描述的氨基酸分析方法利用LC-MS对粗细胞培养基中未成年氨基酸进行快速定量。替代氨基酸分析方法需要氨基酸衍生剂,以实现紫外线检测26。与LC-UV方法相比,LC-MS方法具有重要优势:它允许根据保留时间和电子质量进行识别,而不是LC-UV方法,后者因缺乏质量表征而受到限制。此外,LC-MS方法提供了时间和可重复性优势,因为LC-UV方法需要耗时的导导反应,这可能具有样品变异性27。然而,在LC-MS方法中注入粗细胞培养基,由于光子脱污剂结垢,会对MS信号造成有害影响。校准梯作为系统适用性检查频繁注入,样本顺序被随机化,以防止数据中的偏差。
使用微生物反应器生产抗体的细胞培养过程是9.在这项研究中,对单克隆抗体表征方法的详细协议进行了明确定义,这些方法可最大化从有限样本量中获得的数据。捕捞的细胞培养液数量有限,有时会限制所获取的产品信息,选择正确的分析程序以获得产品质量数据至关重要。分析对于将上游流程参数与产品质量变化联系起来非常重要。在这里,为用户提供了在使用微生物反应器时对mAbs进行表征的指南。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢斯科特·卢特提供的分析支持。CDER 关键路径计划 (CA #1-13) 为这项工作提供部分内部资金和支持。这个项目的部分支持是被任命为美国食品和药物管理局生物技术产品办公室的实习/研究参与计划,由橡树岭科学与教育研究所管理,美国能源部和FDA之间的机构间协议。
CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
Akta Avant 25 | General Electric Life Sciences | 28930842 | |
Pro Sep vA Ultra Chromatography Resin | Millipore Sigma | 115115830 | Purification Stationary Phase |
Omnifit 10cm Column | Diba Fluid Intelligence | 006EZ-06-10-AA | Housing for Stationary Phase |
Tris Base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
Superloop 10 mL | GE Healthcare | 18-1113-81 | |
µDawn Multi Angle Light Scattering Detector | Wyatt | WUDAWN-01 | |
0.22 µm Millex GV Filter Unit PVDF Membrane | Merck Millipore | SLGV033RB | |
10X Phosphate Buffered Saline | Corning | 46-013-CM | |
12 mL Syringe | Covidien | 8881512878 | |
1290 Infinity Binary Pump | Agilent Technologies | G4220A | |
1290 Infinity DAD | Agilent Technologies | G4212A | |
1290 Infinity Sampler | Agilent Technologies | G4226A | |
1290 Infinity Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
1290 Infinity Thermostatted Column Compartment | Agilent Technologies | G1316C | |
15 mL Falcon tube | Corning Inc. | 352097 | |
150 uL Glass Inserts with Polymer Feet | Agilent Technologies | 5183-2088 | |
50 mL Falcon tube | Corning Inc. | 352070 | |
96-Well Plate | Bio-Rad | 127737 | |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695072 | |
Acetonitrile | Fisher Chemical | BPA996-4 | |
ACQUITY I-Class UPLC BSM | Waters Corporation | 18601504612 | |
ACQUITY I-Class UPLC Sample Manager | Waters Corporation | 186015000 | |
ACQUITY UPLC FLR Detector | Waters Corporation | 176015029 | |
Amicon Ultra-4 100 kDa centrifugal filters | Merck Millipore | UFC810096 | |
Amino Acid Standard, 1 nmol/µL | Agilent Technologies | 5061-3330 | |
Amino Acid Supplement | Agilent Technologies | 5062-2478 | |
Ammonium Formate Solution – Glycan Analysis | Waters Corporation | 186007081 | |
Blue Screw Caps with Septa | Agilent Technologies | 5182-0717 | |
CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
Charge Variant Chip | Perkin Elmer | 760435 | |
Charge Variant Reagent Kit | Perkin Elmer | CLS760670 | |
Chromatography Water (MS Grade) | Fisher Chemical | W6-4 | |
Dimethylformamide | Thermo Scientific | 20673 | |
Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates | Waters Corporation | 186001831 | |
Formic Acid | Fisher Chemical | A117-50 | |
GlycoWorks RapiFlour-MS N-Glycan Starter Kit – 24 Sample | Waters Corporation | 176003712 | |
GXII Buffer Tubes | E&K Scientific | 697075- NC | |
GXII Detection Window Cleaning Cloth | VWR | 21912-046 | |
GXII HT Touch | Perkin Elmer | CLS138160 | |
GXII Ladder Tubes | Genemate | C-3258-1 | |
GXII Lint-Free Swab | ITW Texwipe | TX758B | |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | |
Intact mAb Mass Check Standard | Waters Corporation | 186006552 | |
Intrada Amino Acid Column 150 x 2 mm | Imtakt | WAA25 | |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 840274100 | |
Optilab UT-rEX Differential Refractive Index Detector | Wyatt | WTREX-11 | |
Perchloric acid | Aldrich Chemistry | 311421 | |
Pipet Tips with Microcapillary for Loading Gels | Labcon | 1034-960-008 | |
Polypropylene 96-Well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 | |
RapiFlour-MS Dextran Calibration Ladder | Waters Corporation | 186007982 | |
Screw Top Clear Vial 2mL | Agilent Technologies | 5182-0715 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
Sodium Iodide | Sigma Aldrich | 383112 | |
TSKgel UP-SW3000 4.6mm ID x 30 cm L | Tosoh Biosciences | 003449 | |
UNIFI Scientific Information System | Waters Corporation | 667005138 | |
Vacuum Manifold Shims | Waters Corporation | 186007986 | |
Vacuum Pump | Waters Corporation | 725000604 | |
Xevo G2 Q-ToF | Waters Corporation | 186005597 | |
Zeba Spin Desalting Column, 0.5 mL | Thermo Scientific | 89883 |