En los ensayos de Vitro para evaluar la migración, invasión y proliferación de las líneas de células inmortalizadas trofoblasto humano de primer trimestre
Summary
Aquí, presentamos un protocolo altamente accesible para evaluar el movimiento de la célula en células de trofoblasto humano mediante tres ensayos in vitro: el ensayo de rayado, el ensayo de invasión transwell y el ensayo de proliferación celular.
Abstract
Movimiento celular es una propiedad crítica de trofoblastos durante el desarrollo placentario y embarazo precoz. Se demuestra la importancia de la migración del trofoblasto adecuada e invasión por trastornos de embarazo tales como restricción del crecimiento intrauterino y de la preeclampsia, que se asocian con invasión inadecuada del trofoblasto de la vasculatura materna. Por desgracia, nuestra comprensión de los mecanismos por el que se desarrolla la placenta migre trofoblastos es limitada. Análisis in vitro de la migración celular mediante el ensayo de scratch es una herramienta útil en la identificación de factores que regulan la capacidad migratoria de trofoblasto. Sin embargo, este ensayo sólo definir los cambios celulares que pueden resultar en migración de la célula alterada. Este protocolo describe tres diferentes ensayos in vitro que se utilizan conjuntamente para evaluar movimiento de trofoblasto celular: el ensayo de rayado, el ensayo de invasión y el ensayo de proliferación. Los protocolos descritos aquí pueden modificarse para su uso en otras líneas celulares para cuantificar el movimiento de la célula en respuesta a estímulos. Estos métodos permiten a los investigadores a identificar los factores individuales que contribuyen al movimiento de la célula y un minucioso examen de los mecanismos potenciales subyacentes cambios aparentes en la migración celular.
Introduction
Desarrollo placentario es un paso crucial en el establecimiento del embarazo, que afectan la salud materna y fetal. Sin embargo, la base mecanicista por el cual este proceso se produce no se entiende completamente. Migración celular es un proceso biológico importante que contribuye a la creación y funciones de la placenta durante el embarazo. Tras la implantación del blastocisto, el trophectoderm distingue en trofoblastos vellosos, que cubren la superficie de las vellosidades coriónicas y participan en el intercambio de nutrientes y gas, y trofoblastos extravillous (EVTs), que migran hacia fuera de las vellosidades e invaden la decidua y la vasculatura materna1. La migración de las EVTs es esencial para la remodelación de las arterias espirales maternas y el establecimiento de la circulación uteroplacentaria para apoyar crecimiento fetal2. Invasión inadecuada del trofoblasto durante el embarazo resulta en desarrollo placentario anormal y puede contribuir a complicaciones del embarazo como preeclampsia, hipertensión gestacional, restricción del crecimiento intrauterino y parto prematuro3, 4. Por lo tanto, entender los factores que afectan la motilidad de trofoblasto es esencial para determinar los caminos necesarios para la placentación normal.
Migración del trofoblasto es controlada por una compleja red de moléculas, incluyendo factores de crecimiento, citoquinas, hormonas y de factores angiogénicos5de señalización. Debido a las limitaciones del estudio de la placenta en vivo, ensayos in vitro utilizando inmortalizaron células de trofoblasto humano líneas han sido cruciales para identificar factores que contribuyen a la movilidad del trofoblasto. Pruebas de Scratch y la invasión se han utilizado ampliamente para evaluar cuantitativamente la función de moléculas individuales en trofoblasto celular migración6,7,8. Sin embargo, aunque útil para tandem para investigar cómo cambios en la migración pueden ser causados por cambios en la invasividad celular, estos dos ensayos no representan mecanismos adicionales que pueden contribuir a tasas de alteración de migración celular. Por ejemplo, las reducciones a la tasa de proliferación celular pueden resultar en menos células disponibles para migrar.
Aquí, describimos métodos cuantitativos in vitro para evaluar la migración del trofoblasto con rasguño, proliferación celular y los ensayos de invasión celular. En el ensayo de rayado, se crea una herida uniforme en una monocapa de células y la migración de células para llenar el vacío se mide por la proyección de imagen automatizada, Time-lapse del tamaño de la herida y la densidad de células dentro de la herida. El ensayo de proliferación celular se basa en calcular la proporción de células en cada punto de tiempo en comparación con una cantidad conocida a partir de las células. En el ensayo de invasión celular, las células se siembran en la cima de una cámara de inserción de cultura celular recubierto por la matriz extracelular (e.g. Transwell), y se contó el número de células que invaden a través de la matriz extracelular en respuesta a quimio-atrayente.
El scratch es una herramienta sencilla y eficaz que puede utilizar para determinar cómo las diferentes condiciones ambientales afectan la migración de la célula. Los ensayos de proliferación y la invasión pueden utilizarse posteriormente para determinar la contribución de la proliferación celular y la invasión a general cambios en la migración celular. Colectivamente, estos ensayos proporcionan medidas robustas de los procesos biológicos que pueden contribuir a la movilidad de la célula. Dos líneas de células inmortalizadas trofoblasto durante el primer trimestre fueron utilizadas en el análisis descritos, Swan.71 (Sw.71) y HTR-8/SVneo9,10. Sin embargo, estos ensayos también pueden ser optimizados para su uso en otros tipos celulares para identificar los principales moduladores de la migración celular y la invasión.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este procedimiento basa en el uso de migración y la invasión ensayos para incluir la tasa de proliferación celular como un colaborador potencial medidos diferencias en el movimiento de células de trofoblasto. Juntos, estos ensayos in vitro son métodos sencillos y eficaces que pueden utilizarse para identificar las vías celulares que regulan la migración del trofoblasto. Como se describió anteriormente, las células del trofoblasto pueden tratarse con hormonas, citoquinas, factores de crecimiento y otras molécula…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Dr. Gil Mor para proporcionar las células Sw.71. Esta investigación fue apoyada por un Premio Albert McKern erudito para S.W.
Materials
| 0.4% Trypan blue stain | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| 1.0 M HEPES | AmericanBio | AB06021-00100 | |
| 10 mM MEM non-essential amino acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 24-well plate transwell inserts | Corning | 3422 | Contain polycarbonate filters with an 8 μm pore size |
| Charcoal dextran-stripped FBS | Gemini Bio-Products | 100-119 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific | 8310-4 | |
| Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9α-fluoro-16α-methyl-11β, 17, 21-triol-3, 20-dione; ≥98% TLC) | Steraloids | P0500-000 | |
| DMEM/Ham’s F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
| IncuCyte 24-well ImageLock Plates | Essen BioScience | 4365 | If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view. |
| IncuCyte software | Essen BioScience | 2010A Rev2 | |
| IncuCyte ZOOM system | Essen BioScience | N/A | Scratch assay images were captured and analyzed using the preset “Scratch Wound” parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used. |
| Matrigel Membrane Matrix | Becton Dickinson | 356231 | Growth factor reduced, phenol-red free |
| Micro Slides | VWR International, LLC | 48311-7003 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 151-40-122 | |
| Phenol-red free DMEM/Ham's F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
| Semi-automatic wound maker tool | Essen BioScience | N/A |
Riferimenti
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