Isolamento de células endoteliais Microvascular do principal músculo esquelético murino
Summary
Células endoteliais microvasculares dos músculos esqueléticos (MMEC) forma a parede interna dos capilares musculares e regular a ambos, troca de fluidos/moléculas e migração de células (imunes) entre o tecido muscular e sangue. Isolamento de MMEC murino primário, conforme descrito aqui, permite investigações in vitro abrangentes da unidade”myovascular”.
Abstract
As células endoteliais dos capilares do músculo esquelético (músculo microvascular em células endoteliais, MMEC) construir a barreira entre a corrente sanguínea e músculos esqueléticos, regulamenta a troca de fluidos e nutrientes, bem como a resposta imune contra infecciosas agentes, controlando a migração celular imune. Para essas funções, MMEC formam um funcional “unidade de myovascular” (MVU), com mais tipos de células, como fibroblastos, pericitos e células do músculo esquelético. Por conseguinte, uma disfunção do MMEC e, portanto, o MVU contribui para uma vasta variedade de miopatias. No entanto, mecanismos reguladores do MMEC na saúde e na doença permanecem insuficientemente compreendidos e sua elucidação precede a tratamentos mais específicos para miopatias. O isolamento e a investigação aprofundada das principais funções do MMEC no contexto do MVU podem facilitar uma melhor compreensão destes processos.
Este artigo fornece um protocolo para isolar MMEC murino primária do músculo esquelético por dissociação mecânica e enzimática, incluindo a purificação e etapas de manutenção da cultura.
Introduction
Via corrente sanguínea, células e órgãos são fornecidos com oxigênio, substratos e outras moléculas necessárias. Este intercâmbio ocorre em capilares, vasos menores. Os capilares são formados por uma camada interna de células endoteliais (CE) cuja integridade continua a ser um pré-requisito para o sucesso regulação da homeostase do músculo entre o espaço intravascular e intersticial. Para garantir uma transição seletiva de células e fatores solúveis, CE constituem uma monocamada interligados por firme e aderente junções 1. Além de seu papel como barreira para nutrientes ou produtos metabólicos, CE regula o recrutamento de leucócitos em processos inflamatórios. Danos no tecido ou inflamação leva a uma regulação de moléculas de adesão na superfície do CE e produção de quimiocinas, facilitando a fixação dos leucócitos e transmigração no tecido alvo 2. Por conseguinte, CE criticamente estão envolvidos na regulação de processos inflamatórios, tais como a defesa contra patógenos ou reparação dos tecidos.
Uma disfunção da CE está diretamente associado com doenças vasculares, insuficiência renal crônica, infecções de patógeno grave de trombose venosa. Além disso, a CE praticamente sempre estão envolvidos em auto-imunidade órgão-específicas, tais como diabetes mellitus ou esclerose múltipla 3. A função de barreira entre o fluxo de sangue e órgãos, portanto, é controlada por uma interação concertada de diferentes tipos de células. As músculo esquelético microvascular células endoteliais (MMEC) juntamente com células musculares, fibroblastos e pericitos formam uma unidade funcional, a unidade de”myovascular” (MVU). Portanto, uma disfunção do MVU pode desempenhar um papel crítico na fisiopatologia de miopatias. No entanto, uma compreensão mais profunda desses mecanismos regulatórios ainda está desaparecida e atualmente impede a identificação dos alvos novos, urgentes, terapêuticos em miopatias.
Para investigar os complexos mecanismos fisiológicos e fisiopatológicos, modelos animais são comumente usados. No entanto, em vitro modelos oferecem a vantagem de focar o assunto de interesse, excluindo uma variedade de fatores de confundimento. Para investigar processos in-vitro é necessário isolar as células primárias puras e viáveis. Em contraste com linhas de células, as células primárias isoladas de animais transgénicos permitem para investigar as consequências das modificações genéticas in vitro.
Aqui, um método para isolar MMEC murino primário é descrito usando dissociação mecânica e enzimática, seguida por magnético celular ativado classificação técnicas (MCS) para a purificação. Para este efeito, grânulos magnéticos contra marcadores de superfície específicos são utilizados. Plaquetas células endoteliais adesão molécula-1 (PECAM1, CD31) manifesta-se principalmente na CE e pode ser usado para enriquecer este tipo de célula. Para garantir a pureza elevada célula, células de origem hematopoiética são excluídas por uma seleção negativa para proteína tirosina fosfatase receptor tipo C (PTPRC, CD45). Além disso, são apresentados os controles de qualidade, cultivo de primário MMEC murino, aplicações potenciais e limitações, bem como considerações especiais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Células endoteliais microvasculares fornecem funções de barreira em todos os tecidos e seus resultados de disfunção na doença dos órgãos associados 3. Além disso, estudos de órgãos específicos da CE microvascular podem pavimentar o caminho para novas estratégias terapêuticas. Portanto, uma compreensão mais profunda da função microvascular de CE sob condições fisiológicas e fisiopatológicas é de grande interesse científico. Modulação da interação dos leucócitos/endotéli…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo “mais Kröner-Fresenius-Stiftung” (2018_A03 a TR), “Inovador Medizinische pesquisa (FMI) Münster” (I-RU211811 a TR) e Fundação de pesquisa alemã (DFG, INST 2105/27-1, ME 3283/5-1 e ME 3283/6-1 para SGM). Ilustrado imagens fornecidas por Heike Blum.
Materials
| 0,25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200-056 | ready to use |
| ACK buffer | 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3 | ||
| Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) | Biolegend | 102506 | Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl |
| Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) | Biolegend | 103106 | Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Basic fibroblast growth factor |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| CD31 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| CD45 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Collagenase-Dispase | Roche | 10269638001 | Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa |
| Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates | Corning | 3516 | |
| Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody | dianova | 712-166-153 | |
| DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) | Thermo Fisher | P36935 | |
| Desoxyribonuclease | Sigma Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas |
| Diethylpyrocarbonat treated water | Thermo Fisher | AM9916 | |
| DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate | Thermo Fisher | 31966-021 | warm up to 37 °C before use |
| dNTP Mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | 1 mL |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| FACS tubes | Sarstedt | 551,579 | |
| Falcon 70 μm Cell Strainer | Corning | 352350 | |
| FC buffer | 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA | ||
| Fetal calf serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal calf serum |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix) | Braun | 9161708V | |
| large magnetiv columns (LS columns) | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for CD45-MACS-step |
| MCS buffer | 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2 | ||
| Medium magnetic column (MS column) | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for CD31-MACS-step |
| Nuclease free water | Thermo Fisher | R0581 | |
| PBS | Sigma Aldrich | Phosphate buffered saline, ready to use | |
| PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | in a kit with the reverse transcriptase |
| Pecam1 rat α-mouse | SantaCruz | Sc-52713 | 100 µg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| primary murine muscle cells | celprogen | 66066-01 | |
| Primer Cdh15 (M-Cadherin) | Thermo Fisher | Mm00483191_m1 | FAM labeled |
| Primer Cldn5 (claudin-5) | Thermo Fisher | Mm00727012_s1 | FAM labeled |
| Primer Ocln (occludin) | Thermo Fisher | Mm00500912_m1 | FAM labeled |
| Primer Pax-7 | Thermo Fisher | Mm01354484_m1 | FAM labeled |
| Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) | Thermo Fisher | Mm00493699_m1 | FAM labeled |
| Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) | Thermo Fisher | 4310893E | VIC labeled |
| qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Fisher | K0231 | 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each |
| Random mixture of single-stranded primer | Thermo Fisher | SO142 | Random Hexamer Primer |
| Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | |
| Rnase Inhibitor (40 U/μL) | Thermo Fisher | EO0381 | |
| Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) ) | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Speed Coating solution | PeloBiotech | PB-LU-000-0002-00 |
Riferimenti
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