Colletotrichum fioriniae Развитие в воде и хлороформе основе черники и клюквы цветочные экстракты

1. грибковые изолятов и суспензий спор Изолируйте Colletotrichum fioriniae от естественно зараженных принимающей19. Затем Храните чистых культур на скошенный агар (CMA) кукурузной муки. Поместите вилку культуры (от CMA наклонная) на стандартные пластиковые клетки культуры блюдо (9 см в диаметре) содержащий либо уточнить V8 сок агар (cV8A) (с изменениями от 1955 Миллер), или не уточнил V8 сок агар (V8A)20. Когда колонии начинают sporulate, полоса конидий (оранжевый конидиальная массы) на другой cV8A или V8A содержащие клетки культуры блюдо (с стандартного цикла стерильные) производить высокой плотности аэроб культуры.Примечание: Любой протокол шаги с грибов должны выполняться в Ламинарный шкаф для уменьшения вероятности заражения грибковых культур и/или bioassays. После того, как 7 дней роста, с помощью стандартного цикла стерильные собрать небольшое количество конидий из высокой плотности культуры (, слегка касаясь цикла конидиальная массы) и перемешать это в 15 мл пластиковых пробирок, содержащие 10 мл стерильной деонизированной воды (ТБО). Вихревой этот пример для 10 s, а затем с помощью стандартной пипетки окунуться вверх и вниз несколько раз далее смесь образца. Затем поместите каплю vortexed образца на Горяева и оценки концентраций спор. Фото 5-10 поля на Горяева, получить среднее и умножить средний коэффициент соответствующие разрежения (т.е. 10 000), таким образом получение конидиальная концентрации на мл ТБО. Затем с помощью объем (V) / концентрации (C) уравнение (V1● [1C] = V2● [2C]) отрегулируйте (с ТБО) до 1,0 X 105 конидий мл ТБО с 5 мл окончательный объем. Это называется споро подвеска и производится только непосредственно перед использованием в любом биопроб. 2. активное, на водной основе цветочных экстрактов (активных -FE)15,16 Примечание: См. дополнительная цифра 1, дополнительная цифра 2, дополнительная цифра 3и Дополнительные фильм 1. Тщательно ручной сбор черники (апрель-май) и клюквы (июнь-июль) цветы во время их соответствующих пик цветения в поле (Дополнительные рис. 1). Носите и изменить нитриловые перчатки местоположениях (сортов/сорта/физического расположения) выборки подавляют кожи человека нефтяного загрязнения, а также перекрестного загрязнения между цветочных сортов. Место черники или клюквы цветы (от одного источника) в пластиковые мешки (заполнить мешок 100 x 150 мм) и сразу же хранить в холодильнике при температуре 4 ° C после того, как цветы собраны.Примечание: Добыча – активно изменяется от Леандро и др. (2003) 16. До извлечения удалите любые ухудшилось, поврежденные, пораженные цветы, а затем с помощью здорового цветы Удаление яичников, Чашелистики и плодоножек с щипцы изогнутые (45о пинцет) и отменить. Используйте только остальные органы (corolla, стигма, стиль и тычинки) для активных – экстракции. Вырезать марлю (150 x 150 мм) и место в воронку 7 x 7 мм, поместить в чистой 50 мл пластиковых пробирок и отложите в сторону. Смешайте 1 часть обработана цветы на 9 частей ТБО (1 Вт: 9 соотношение vol) в ступке. Осторожно растереть с пестиком для 30 s (Позаботьтесь, чтобы распылить не полностью образцы). Штамм результате пульпы через подготовленный марлю/воронку и собирать в пластиковых пробирок (50 мл). Очистить или использовать новый раствор/пестиком между каждой добыча с 95% EtOH и теплой проточной водой. Подготовьте аппарат вакуумной фильтрации: собрать Buchner воронка, вакуумный фильтр колбу Эрленмейера (объемом до 1000 мл), 55 мм круг фильтровальная бумага и вакуумный шланг/источник. Добавление соответствующего размера Buchner воронка фильтровальная бумага и место на вершине колбу, а затем подключить аппарат к воде / всасывания источника через вакуумный шланг и отложите в сторону. Дальнейшего уточнения цветочных экстрактов черники центрифугированием 10 мин на 8,055 x g. Слить супернатант в подготовленный фильтр Вакуумный аппарат, включите источник вакуума, фильтр супернатанта, затем вылить содержимое колбы в новых пластиковых пробирок (50 мл). Очистите все компоненты аппарата между каждой фильтрации 95% EtOH и теплой проточной водой. Дальнейшее фильтр через шприц адаптирована с 0,22 мкм размер поры, ацетат стерилизации, фильтр в новом пластиковых пробирок (50 мл). Клюква цветочные экстракты только вакуум фильтр через фильтровальную бумагу и залить содержимое колбы в новых пластиковых пробирок (50 мл). Результате подготовка называется активной- цветочные экстракт (Активный -FE). Храните все на водной основе цветочные экстракты (Активные-, пассивный-, дождевой) при-20 ° C в 5-50 мл аликвоты до экспериментального использования. Повторите экстракции с несколько образцов (по крайней мере 3 извлечения каждого образца типа) для предоставления реплицирует. 3. пассивный , на водной основе цветочных экстрактов ( пройти -FE) 16 Примечание: Смотрите Дополнительные фильм 2. Ручной сбор всей голубики цветы (50 g) выше и хранить в холодильнике после сбора. До извлечения удалите любые ухудшилось, поврежденные, пораженные цветы и только цветоносах в нетронутыми цветок. Охладите подготовленных образцов, до тех пор, пока пассивно – вытяжной системы, описанные ниже, находится в месте. Промойте все компоненты до использования с 95% этанола (EtOH) и теплой проточной водой для предотвращения загрязнения (пластиковые сетки листа, две корзины пластиковые сетки, стеклянные ёмкости и туман бутылка насоса). Также подготовьте 4 слоя Марли/трубы/50 мл пластиковых пробирок для каждого извлечения как описано выше (на шаге 2.2) и отложите. Подготовьте сито: место пластиковые сетки листа (ака ясно бар матирования) в корзину одной пластиковой сетки (114 x 102 мм). Переверните второй, идентичные, Сетка корзины (перевернутый) в стеклянных хлеб Пан (127 x 229 мм) (чтобы избежать цветы, сидя в ТБО) и место сетки листа содержащие корзины на вершине. Добавьте 50 г подготовленных цветов в сито.Примечание: в качестве альтернативы, небольшой тест трубки [чистки] корзины может использоваться вместо первоначально используется пластиковая Сетка корзины (старый, зеленый, клубника Сетка корзины пинта зачастую трудно источника). Равномерно туман цветы с 250 мл с помощью насоса туман бутылки и захвата стока в стеклянные ёмкости. Затем процедите фильтрата через подготовленный марлю/воронку в чистых пластиковых пробирок. Результате подготовка называется пассивным- цветочные экстракт (перевал -FE); хранить как за выше (шаг 2.6). Очистите все компоненты между каждой добыча с 95% EtOH и теплой проточной водой. Повторите экстракции с несколькими образцами предоставлять реплицирует (по крайней мере 3 каждого образца типа). 4. на основе хлороформ цветочные экстракты (ch-FE) 17 Сбор черники и клюквы цветы согласно выше (шаг 2.1) и подготовить цветы для извлечения (шаг 2,2, без подготовки марлю/воронку). Держите подготовлен цветы, охлажденный до использования. Любые работы с хлороформом должны быть выполнены в вытяжной шкаф по соображениям безопасности. Это включает подготовку материалов / посуда, процедуры извлечения и биопроб проводимости (шаги с помощью ch-FE). Очистить все компоненты с 95% EtOH дважды, а затем дважды с хлороформом для предотвращения загрязнения для каждого извлечения: резьбовых стеклянных трубок культуры, 2 стеклянные стаканы, экран маленький из нержавеющей стали и выпускник цилиндр [стекла]. Отложите в сторону для сухой вверх вниз. Промойте политетрафторэтилена (ПТФЭ) выстроились шапки дважды с 95% EtOH только (хлороформ будет повреждения наружных материалов крышку) и отложите в сторону для просушки. Смешайте 1 часть обработана цветы на 9 частей хлороформа (1 wt: 9 соотношение vol) в стакан (цветы затем хлороформ), аккуратно водоворот для 30 s и процедить через сито из нержавеющей стали в второй стакан. Налить ch-FE от второй стакан в культуре стеклотрубки (10-15 мл) и прикрепите крышку PTFE. Заверните крышку с парафина для предотвращения испарения. Этот препарат является хлороформ цветочные экстракт (ch-FE). Магазин образец в темноте (для уменьшения света деградации) при 4 ° C до экспериментального использования. Повторите экстракции с несколькими образцами предоставлять реплицирует (по крайней мере 3 каждого образца типа). 5. сбор дождевой воды из черники цветы (BB rw-FE)16 Примечание: Блуберри цветочные дождевой воды коллекции устройство состоит из воздуха распылителем одноразовые краска спрей Кубка с адаптер (Кубок: Внутренняя резьба, адаптер: мужчины к мужчине поток), 50 мл пробирок (полипропилен), парафина и пластиковые покрытием провода ( стандартные телефонные провода, отдельные внутренние провода нити содержимое). Выберите несколько мест в пределах Буш Черника захватить запустить офф цветы до создания устройства для сбора дождевой воды. К ним относятся непосредственно под соцветия (цветок) в самом фундаменте Буша (Корона). Запись диаметр стволов (начиная от 1-5 см) в отдельных местах, как это будет диктовать размер отверстия для крепления устройства, описанные ниже. Для каждого выбранного местоположения создайте устройство коллекции. Сначала просверлите отверстие в нижней части спрей Кубка (где Кубок кривые направлении резьбовое отверстие) для соответствующего диаметра ствола, с небольшим шагом, придает сверлильный станок. Затем вырежьте прямую линию от верхней части thehole до устья Кубок спрей. Просверлить 4 равноотстоящих (достаточно большой, чтобы поток пластиковые проволока с покрытием,) в устье спрей Кубок и подключите один конец пластиковые покрытием провода, оставляя один конец бесплатно. Просверлите отверстие достаточно большой, чтобы поток краски опрыскиватель Кубок адаптер в крышка крышка центрифуги 50 мл. Уплотнение адаптер потоков с парафина для предотвращения утечки. Приложите это Крышка центрифуги и резьбовой части распылителя Кубка. Прикрепите растяжением 50 мл пластиковых пробирок. Повторите шаги 5.3-5.4 для создания нескольких устройств согласно выбранных местоположений, минимум 4 коллекции устройств на месте отбора проб. Развертывание устройств в отдельных местах, разминая чашки распылителя помещается на стеблях. Ориент стороне вырезать спрей Кубка вверх используя пластиковым покрытием проводов прилагаемом к другим стебли (застраховать, что захвачен воды, проходя над Цветы). Аффикс парафина всех отверстий, которые могут протекать дождевой воды. (Дополнительная цифра 3, дополнительная цифра 4, дополнительная цифра 5и Дополнительные рис. 6). Метки коллекции трубок с развертыванием Дата / время. После дождя события, удалить и заменить часть нижней (трубка) пластиковых пробирок (метку даты / времени сбора). Принесите стока коллекций (упоминаемый как цветочные экстракт черники дождевой воды (BB rw-FE)) внутри и вакуумный фильтр (фильтрации, описанные в шагах 2,4-2,5). Магазин как выше (шаг 2.6), до тех пор, пока используется в биопроб на водной основе. 6. сбор дождевой воды из клюквы цветы (CB rw-FE) Устройство сбора цветочные дождевой воды в Клюква состоит из 7 X 7 cm полипропиленовые воронки, 50 мл пробирок (полипропилен), парафина, и 4 стандарта, пластиковые покрытием перевязку (на устройство). Во-первых тепло прокол 8 равноотстоящих отверстия (диаметром перевязку) вокруг устья воронки, используя металлический зонд. Вставьте перевязку в 4 отверстия. Прикрепите Другие концы к противоположной местоположение этого отверстия, формируя шаблон аккуратно пересечения. Оберните воронкой вниз стебель с парафина и отложите в сторону. Просверлите отверстие достаточно большой, чтобы вставить воронкой вниз стволовых в 50 мл центрифуги колпачок с небольшим шагом. Вставьте подготовленных воронка Крышка центрифуги. Повторите шаги 6.2-6.3 для создания нескольких устройств, минимум 4 коллекции устройств на месте отбора проб. Развертывание устройства помечены (Дата/время) в выбранных клюквенный болота. Аккуратно прижмите два соцветия подшипник цветок (известный как стоек) под скрещенных пластиковые перевязку. Затем по вертикали ориентации устройства, пирсинг пластиковых пробирок в клюквенный навесом (дополнительные цифры 7-8, дополнительные 3 фильма). После дождя или накладные полива удалить и заменить часть нижней (трубка) пластиковых пробирок (метку даты / времени сбора). Принесите стока (упоминаемый как цветочные экстракт клюквы дождевой воды (CB rw-FE)) внутри и вакуумный фильтр (фильтрации, описанные в шагах 2,4-2,5). Магазин как выше (шаг 2.6), до тех пор, пока используется в биопроб на водной основе. 7. биопроб, используя воды на основе цветочные экстракты,1516 (активных-FE, пройти-FE, rw-FE) Примечание: Смотрите Рисунок 1. Этот bioassay готовится в Ламинарный шкаф. Подготовка материалов: тройной промыть стекло coverslips с 95% EtOH и воздух сухой, затем отложить в сторону. Отрезные диски бумаги полотенце на внутренний диаметр стандартные пластиковые клетки культуры блюд (9 см). Место 2 слоев бумажных дисков в пределах культуры блюда и замочить с 2 мл ТБО. Подготовьте по крайней мере 5 мл на 1,0 X 10 конидий5 мл ТБО споро подвески (C. fioriniae) согласно выше (шаг 1.2-1.4), отложите в сторону. Далее смесь равных объемов ТБО и водной основе цветочные экстракт в 2 мл microcentrifuge трубы. Затем, добавьте равное количество споро подвеска трубы microcentrifuge подготовленный 2 мл (ТБО плюс FE); результате подготовка называется смесь водного лечения. Для элемента управления опустить часть FE и заменить с ТБО, чтобы сохранить согласованность конидиальная концентрации.Примечание: размер порции зависит количество реплицирует и моменты времени. Как правило части не превышает 500 мкл. После того, как сочетаются конидий и FE биопроб началось, 0 h после прививки. Место coverslips предварительно очищенного стекла на вершине пропитанной бумажные полотенца в пределах клетки культуры блюдо. Положите капельку 40 мкл водного лечения смеси на центр coverslip. Повторите для желаемого лечения, включая контроль, закройте клетки культуры блюдо. Повторите в отдельную ячейку культуры блюда для репликаций (по крайней мере 3) и моменты времени (каждое блюдо для 1 момент времени). После того, как все процедуры и реплицирует было обойтись, поместите все реплицированные клетки культуры блюда в запечатанный пластиковый контейнер (30 x 13 x 7 мм) и инкубировать при 25° C в темноте. На заранее время очки, добавить 10 мкл фиксатором как lactophenol хлопок синий (20,0 г фенола кристаллы, 20,0 мл 2,5% молочной кислоты, 40.0 мл глицерина, голубой хлопок 0,05 г) капельки, остановка роста и частично сохраняя горе. Подождите 2 h, чтобы собирать точки время 0 h, как это позволяет конидиальная адгезии к поверхности стекла, но не достаточно долго, для проращивания конидиальная. Для всех других точек время добавьте фиксатором в соответствующее время. После добавления фиксатором, тщательно Инвертируйте coverslips, помещая их капелька стороной вниз на стекло микроскопа для упрощения микроскопическом исследовании (1 coverslip на слайд). Когда все coverslips на стеклянных скольжениях микроскопа, оставить им селиться и частично сухой в капот потока за 20 мин. Граф все конидий (всего конидий) представить на coverslip (первичный конидий проросшие конидий и вновь образованного среднего конидий), а также appressoria или 400 X увеличение (считая 16 полей) или 200 X (считая 4 поля), общей площадью 3.808 мм 2. повторить весь биопроб для статистического анализа. Для анализов с использованием водной основе FE анализа данных, как описано в Уоллер и др. 201716, обычно показано как среднее/мм2 (всего конидий или appressoria). 8. биопроб, используя на основе хлороформ цветочных экстрактов (ch-FE)17 Примечание: Смотрите Рисунок 2. Подготовка материалов и клеточной культуры блюда согласно выше (шаги 7.1). Кроме того, промойте равное количество Ван Tieghem (вант клетки) (8 мм OD, ID 6 мм) в coverslips, а также стеклянные пипетки (1 мл с шагом в 1 мкл) внутри Зонта, (дважды с 95% EtOH затем дважды с хлороформ) и отложите в сторону. В Ламинарный шкаф, используя 2-мл пробирку microcentrifuge добавить два равных объемах (по крайней мере 500 мкл части) ТБО и 1 объем споро подвеска, а затем отложите в сторону. Это смесь водного лечения для ch-FE bioassays. В Зонта место вант. ячейка на стекло coverslip в рамках подготовленного пластиковые клетки культуры блюдо. Лунки (с стеклянной пипетки) 33 мкл желаемого ch-FE в центр ячейки т. Ван (не касайтесь стен вант. Ячейка; для контроля лечения, добавить девственной хлороформ) и дайте высохнуть. Повторите в отдельную ячейку культуры блюда для репликаций (по крайней мере 3). После того, как ch-FE сушеные, лунки 99 мкл подготовленный водного лечения смеси с стандартной пипетки в центр вант. ячейки, а затем закрыть все клеточные культуры блюда. После того, как смесь водного лечения вступают в контакт с процедурами сушеные ch-FE, биопроб началось, 0 h после прививки. После того, как все процедуры и реплицирует было обойтись, поместите все блюда (закрытое) клетки культуры в запечатанный пластиковый контейнер (30 x 13 x 7 мм) и инкубировать при 25° C в темноте. В заранее определенных моментов времени мкл 15 фиксатором (lactophenol хлопок синий) для вант. ячейки и пусть сидят по крайней мере 5 минут для обеспечения адекватного грибковые окраски. После этого времени осторожно удалите вант. ячейки и выполните coverslip данных и инверсии приобретение выше (шаги 7,5-7,6). Для анализа данных следуйте методы, описанные в 2015 году замерщика17, обычно отображение данных в виде формирования Аппрессории, который представляет собой отношение общего конидий appressoria насчитал в этом районе наблюдается (3.808 мм2). 9. клюквенный основе Фенология извлечений17 Ручной сбор клюквы цветы (в июне; 100 g), незрелые плоды (дважды; Июль и Август; 200 g) и зрелые Клюква плоды урожая (Октябрь; 200 g), место в размера пластиковые мешки и хранить в холодильнике при температуре 4 ° C сразу же после сбора. Используйте загрязнения меры предосторожности, описанные выше (шаг 2.1).Примечание: Там будет дополнительных растительного материала, собранных на каждый раз, но эти суммы остерегаться извлечение очевидно грибковых зараженных яичников и фрукты (показывая симптомы и признаки болезни). До извлечения удалите любые ухудшилось, поврежденные, пораженные цветы, а затем используя только здоровые цветы, удалите чашелистиков, плодоножек, венчики, рыльца, стили и тычинки с щипцы изогнутые (45 ° пинцет) и отбросить все, но яичников. После того, как собраны яичников, выполнить извлечение хлороформ основанные на 1 Вт: 9 коэффициент vol (подробные шаги 4.2-4.4, используя только яичников). Хранить образцы до тех пор, пока все другие извлечений являются полными, т.е. до биопроб проводимости. Как только фрукты собраны, выполнять на основе хлороформ извлечения (шаги 4.2-4.4, используя собранные плоды вместо цветов), но добавляют 10 г фруктов до 90 мл хлороформа и однажды извлечены, Дайте раствору испарился 9 мл (в результате wt 9 мл 10 g: : vol раствор). Сделайте фрукты извлечений сразу же после сбора в июле, августе и октябре. Хранить как за выше (шаг 4.4) до тех пор, пока все извлечений собираются. После последнего извлечения на основе хлороформ фруктов, поставить все на основе пенологии хлороформ экстрактов, собранные для этот assay биопроб на основе хлороформе и анализировать соответственно (шаги 8.1-8,6).