Síntesis y caracterización de nanopartículas de oro anfifílicas
Summary
Las nanopartículas de oro anfifílico se pueden utilizar en muchas aplicaciones biológicas. Se presenta un protocolo para sintetizar nanopartículas de oro recubiertas por una mezcla binaria de ligandos y una caracterización detallada de estas partículas.
Abstract
Las nanopartículas de oro cubiertas con una mezcla de ácido sulfónico (MUS) de 1-octanethiol (OT) y 11-mercapto-1-undecano (MUS) han sido ampliamente estudiadas debido a sus interacciones con membranas celulares, bicapas lipídicas y virus. Los ligandos hidrófilos hacen que estas partículas sean coloidalmente estables en soluciones acuosas y la combinación con ligandos hidrófobos crea una partícula anfifílica que se puede cargar con fármacos hidrófobos, se fusionan con las membranas lipídicas y resisten adsorción de proteínas. Muchas de estas propiedades dependen del tamaño de las nanopartículas y de la composición de la cáscara de ligando. Por lo tanto, es crucial contar con un método sintético reproducible y técnicas de caracterización fiables que permitan la determinación de las propiedades de las nanopartículas y la composición de la cáscara de ligando. Aquí, se presenta una reducción química de una fase, seguida de una purificación a fondo para sintetizar estas nanopartículas con diámetros inferiores a 5 nm. La relación entre los dos ligandos en la superficie de la nanopartícula se puede ajustar a través de su relación estequiométrica utilizada durante la síntesis. Demostramos cómo se combinan varias técnicas rutinarias, como la microscopía electrónica de transmisión (TEM), la resonancia magnética nuclear (RMN), el análisis termogravimétrico (TGA) y la espectrometría ultravioleta visible (UV-Vis), con caracterizar los parámetros fisicoquímicos de las nanopartículas.
Introduction
La cáscara de ligando de nanopartículas de oro se puede diseñar para exhibir varias propiedades diferentes que se pueden aplicar para abordar los desafíos en la biomedicina1,2,3,4. Esta versatilidad permite el control de las interacciones intermolecularesentre nanopartículas y biomoléculas 5,6,7. La hidrofobicidad y la carga juegan un papel decisivo, así como otros parámetros superficiales que afectan a la forma en que las nanopartículas interactúan conlasbiomoléculas5,8,9. Para ajustar las propiedades superficiales de las nanopartículas, la elección de moléculas tioladas que componen la cáscara de ligando ofrece un sinfín de posibilidades, de acuerdo con las características buscadas. Por ejemplo, una mezcla de moléculas de ligandocon grupos extremos hidrófobos e hidrófilos (por ejemplo, cargados) se utilizan a menudo para generar nanopartículas anfifílicas10,11.
Un ejemplo destacado de este tipo de nanopartículas está protegido por una mezcla de OT y MUS (en adelante llamadas nanopartículas MUS:OT) que se ha demostrado que poseen muchas propiedades relevantes12,13,14. En primer lugar, con una composición de cáscara de ligando de 66% MUS (en adelante 66:34 MUS:OT), la estabilidad coloidal de las nanopartículas es alta, alcanzando hasta 33% de peso en agua desionizada, así como en solución salina tamponada de fosfato (1x, 4 mM fosfato, 150 mM NaCl)15. Además, estas partículas no se precipitan a valores de pH relativamente bajos: por ejemplo, a pH 2.3 y con concentraciones de sal de 1 M NaCl15,estas nanopartículas permanecen coloidialmente estables durante meses. La relación estequiométrica entre las dos moléculas en la cáscara de ligando es importante porque dicta la estabilidad coloidal en soluciones con una alta resistencia iónica16.
Se ha demostrado que estas partículas atraviesan la membrana celular sin portarla, a través de una vía independiente de la energía1,12. La fusión espontánea entre estas partículas y bicapas lipídicas subyace su difusividad a través de las membranas celulares17. El mecanismo detrás de esta interacción es la minimización del contacto entre una superficie hidrofóbica accesible al disolvente y moléculas de agua tras la fusión con bicapas de lípidos18. En comparación con las nanopartículas de MUS (nanopartículas que tienen sólo el ligando MUS en su caparazón), la mayor hidrofobicidad en nanopartículas mixtas MUS:OT (por ejemplo, en una composición de 66:34 MUS:OT) aumenta el intervalo del diámetro del núcleo que puede fusionarse con lípidos bicapas18. Diferentes organizaciones de autoensamblaje de la cáscara de ligando se correlacionan con distintos modos de unión de nanopartículas MUS:OT 66:34 con diversas proteínas, como la albúmina y la ubiquitina, en comparación con las partículas de TODO MUS19. Recientemente, se ha informado que las nanopartículas 66:34 MUS:OT se pueden utilizar como un agente antiviral de amplio espectro que destruye irreversiblemente los virus debido a las fijaciones electrostáticas multivalentes de ligandos MUS y acoplamientos no locales de ligandos OT a cápside proteínas14. En todos estos casos, se ha encontrado que el contenido hidrofóbico, así como el tamaño del núcleo de las nanopartículas, determina cómo se llevan a cabo estas interacciones bionanométricas. Estas diversas propiedades de las nanopartículas MUS:OT han provocado muchos estudios de simulación por ordenador que tenían como objetivo aclarar los mecanismos que sustentan las interacciones entre las partículas MUS:OT y diversas estructuras biológicas como las bicapas de lípidos20.
La preparación de nanopartículas Au protegidas por MUS:OT plantea algunos desafíos. En primer lugar, el ligando cargado (MUS) y el ligando hidrófobo (OT) son inmiscibles. Por lo tanto, la solubilidad de las nanopartículas y de los ligandos debe tenerse en cuenta a lo largo de la síntesis, así como durante la caracterización. Además, la pureza de las moléculas de ligando MUS —específicamente, el contenido de sales inorgánicas en el material de partida— influye en la calidad, reproducibilidad, así como en la estabilidad coloidal a corto y largo plazo de las nanopartículas.
Aquí, se describe una síntesis detallada y caracterización de esta clase de nanopartículas de oro anfifílico protegidas por una mezcla de MUS y OT. Se informa de un protocolo para la síntesis del ligando MUS cargado negativamente para garantizar la pureza y, por lo tanto, la reproducibilidad de diferentes sintetizadores de nanopartículas. A continuación, se informa en detalle del procedimiento para generar estas nanopartículas, basado en una síntesis monofásica común, seguida de una purificación exhaustiva. Se han combinadovarias técnicas de caracterización 21 necesarias, como TEM, UV-Vis, TGA y NMR, para obtener todos los parámetros necesarios para cualquier otro experimento biológico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe primero la síntesis del ligando MUS y, a continuación, la síntesis y caracterización de nanopartículas de oro MUS:OT anfifílicas. Sintetizar MUS con un contenido mínimo de sal permite una mejor fiabilidad de la relación estequiométrica entre los ligandos durante la síntesis de nanopartículas, que es un factor clave para la síntesis reproducible de nanopartículas MUS:OT con un hidrofóbico objetivo contenido (Figura 8). El uso de metanol como disolvente co…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Z.P.G. y F.S. agradecen a la Fundación Nacional Suiza en Ciencias y, específicamente, a la “Ingeniería de Sistemas Moleculares” del NCCR. Z.L. y F.S. agradecen el apoyo de la beca de la División II de la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia. Todos los autores agradecen a Quy Ong por discusiones fructíferas y por revisar el manuscrito.
Materials
| 11-bromo-1-undecene | Sigma Aldrich | 467642-25 ml | |
| Sodium Sulfite | Sigma Aldrich | S0505-250 g | |
| Benzyltriethyl-ammonium bromide | Sigma Aldrich | 147125-25 g | |
| Methanol | VWR | BDH1135-2.5 LP | |
| DI water | Millipore | ZRXQ003WW | Deionized water |
| 1 L round bottom flask | DURAN | 24 170 56 | |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 1.00930 EMD Millipore | |
| Stirring bar | Sigma Aldrich | Z329207, | |
| Dow Corning High Vacuum Grease | Sigma Aldrich | Z273554 ALDRICH | |
| Filtering flask | DURAN | 20 201 63 | |
| Filtering Buchner Funnel | FisherSci | 11707335 | |
| Ethanol >99.8%, ACS, Reagent | VWR | 2081.321DP | |
| Deuterium dioxide | Sigma Aldrich | 151882 ALDRICH | |
| Thioacetic acid 96% | Sigma Aldrich | T30805 ALDRICH | |
| Carbon black | Sigma Aldrich | 05105-1KG | |
| Celite | Sigma Aldrich | D3877 SIGMA-ALDRICH | Filtration medium |
| Condenser | Sigma Aldrich | Z531154 | |
| Hydrochloric acid, ACS reagent 37% | Sigma Aldrich | 320331 SIGMA-ALDRICH | |
| Sodium Hydroxide, BioXtra, pellets (anhydrous) | Sigma Aldrich | S8045 SIGMA-ALDRICH | |
| Centrifuge tubes | VWR | 525-0155P | |
| 250 mL round bottom flask | DURAN | 24 170 37 | |
| 500 mL round bottom flask | DURAN | 24 170 46 | |
| Nitric acid, fACS reagent 70% | Sigma Aldrich | 438073 SIGMA-ALDRICH | |
| Gold(III) chloride trihydrate >99.9% trace metal basis | Sigma Aldrich | 520918 ALDRICH | |
| 1-octanethiol >98.5% | Sigma Aldrich | 471836 ALDRICH | |
| Sodium Borohydride purum p.a.>96% | Sigma Aldrich | 71320 ALDRICH | |
| Separatory funnel | SIgma Aldrich | Z330655 SIGMA | |
| Funnel | DURAN | 21 351 46 | |
| 2V folded filtering papers | Whatman | 1202-150 | |
| Amicon filters | Merck | UFC903024 | |
| Iodine, ACS reagent, >99.8%, solid | Sigma Aldrich | 207772 SIGMA-ALDRICH | |
| 5 mm NMR-Tubes, Type 5HP (high precision) | Armar | 32210.503 | Length 178 mm |
| Methanol-d4 99.8 atom%D | Armar | 16400.2035 | |
| TGA crucible | Thepro | 9095-9270.45 | |
| 400 mesh carbon supported copper grid | Electron Microscopy Science | CF400-Cu | |
| quartz cuvette | Hellma Analytics | 100-1-40 |
Riferimenti
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