Summary

바이러스 성 감염 및 초파리 Melanogaster 상호 작용 호스트-바이러스의 분석의 설립

Published: March 14, 2019
doi:

Summary

이 프로토콜에는 vivo에서 바이러스 감염 초파리 melanogaster 나노 주입 방법 기본적인 기법을 사용 하 여 바이러스-호스트 상호 작용을 분석 하에 설정 하는 방법을 설명 합니다.

Abstract

바이러스 확산 전염병 질병의 주요 원인입니다. 따라서, 바이러스와 호스트 간의 상호 작용을 이해 바이러스 감염의 치료 및 예방의 우리의 지식 확장에 매우 중요 하다. 과일 파리 초파리 melanogaster 입증 하나 항 바이러스 요인에 대해 강력한 유전자 도구 및 높은 보존된 타고 난 면역 바이러스-호스트 상호 작용을 조사 하는 가장 효율적이 고 생산적인 모델 생물 신호 경로. 여기에 설명 된 절차는 바이러스 성 감염을 확립 하 고 성인 파리에서 조직의 항 바이러스 응답을 유도 하 나노 사출 메서드를 보여 줍니다. 이 방법에서는 바이러스 주입 복용량의 정확한 제어 실험 재현성을 높은 수 있습니다. 이 연구에서 설명 하는 프로토콜 파리와 바이러스, 주입 방법, 생존 율 분석, 바이러스 부하 측정 및 항 바이러스 경로 평가의 준비를 포함 한다. 파리의 배경에 의해 바이러스 성 감염의 영향 효과 여기에 언급 했다. 이 감염 방법은 실행 하기 쉬운 그리고 양적 반복; 그것은 바이러스-호스트 상호 작용에 관련 된 호스트/바이러스 성 요인에 대 한 화면을 신호 하는 타고 난 면역 및 바이러스 감염에 대 한 응답에 다른 생물학 통로 사이 누화를 부하에 적용할 수 있습니다.

Introduction

바이러스 성 감염, 특히 arboviruses는Chikungunya 바이러스1, 등으로 신흥 뎅기열 바이러스, 황열병 바이러스2 , Zika바이러스3, 왔다 공중 보건에 큰 위협 전염병 발생 하 여 4. 따라서, 바이러스-호스트 상호 작용의 더 나은 이해 것이 전염병 제어 및 인 간에 있는 바이러스 성 질병의 치료에 대 한 점점 더 중요 해지고 있다. 이 목표에 대 한 더 적절 하 고 효율적인 모델 바이러스 감염을 기본 메커니즘을 조사를 설립 해야 합니다.

과일 파리, Drosophilamelanogaster (D. melanogaster), 바이러스-호스트 상호 작용5,6 를 조사 하는 강력한 시스템을 제공 하 고 인간의 바이러스 성 질병7 공부에 가장 효율적인 모델 중 하나를 것을 입증 했다 , 8 , 9. 높은 보존된 항 바이러스 신호 경로 비교할 수 없는 유전 도구 파리 인간 항 바이러스 연구에 대 한 실제 영향으로 의미 있는 결과 생산 하는 좋은 모델. 또한, 파리 간편 하 고 저렴 한 실험실에서 유지 하 고 감염 시 바이러스와 호스트에서 새로운 규제 요인6,10 의 대규모 검열을 위한 편리.

4 주요 높은 보존된 항 바이러스 경로 (., RNA 간섭 (RNAi) 통로11, JAK STAT 통로12, NF-κB 통로 autophagy 통로13) 최근 초파리 에서 공부 잘 년6. RNAi 통로 대부분 바이러스 감염6,14의 종류를 억제 수 있습니다 광범위 한 항 바이러스 메커니즘입니다. Dicer-2 (Dcr-2) 또는 Argonaute 2 (AGO2) 유전자에 있는 돌연변이 의해이 통로의 파괴 증가 바이러스 titer와 호스트 사망률15,,1617발생할 수 있습니다. JAK STAT 통로에 곤충, 예를 들어 Flaviviridae 가족과 Dicistroviridae 가족에서 바이러스에 의해 감염의 제어에 연루 되어있다., 파리16 및 웨스트 나 일 바이러스 (WNV) 초파리 C 바이러스 (DCV) 고 뎅 기 바이러스 모기18,19에서. 초파리 통행세 (인간의 NF κB 통로를 동종) 및 면역 결핍 (IMD) 경로 (인간의 NF-κB 및 TNF 통로 유사)는 모두 바이러스 침공20,21, 을 방어에 관련 된 22. autophagy는 초파리23,24에 잘 특징 이다 바이러스 성 감염의 규칙에 관련 된 다른 보존된 메커니즘입니다. 따라서, 이러한 경로 및 이러한 항 바이러스 신호 및 다른 사이 해 크로스 토크의 새로운 규제 요인의 식별 대사, 노화, 신경 반응 등 생물학적 경로 설정할 수 있습니다 쉽게 초파리 에서 시스템입니다.

비록 가장 잘 설립 된 바이러스 감염 모델 초파리 에서 RNA 바이러스, 무지개 빛깔의 무척 추 동물 바이러스 6I 감염에 의해 유도 된다 (4-6) 하 고 칼 리 티아 바이러스 DNA 바이러스의 연구에 대 한 잠재적인 파리25, 26. 또한, 바이러스도 인플루엔자 바이러스9같은 초파리의 감염 수 있도록 수정할 수 있습니다. 이 크게 초파리 심사 플랫폼의 응용 프로그램을 확장 했다. 이 절차에서는 우리 초파리에 있는 바이러스 성 감염 시스템을 개발 하는 방법을 설명 하기 위해 예를 들어 DCV 사용 합니다. DCV 9 단백질27인코딩 약 9300 뉴클레오티드의 긍정적인 감각 단일 좌초 된 RNA 바이러스입니다. D. melanogaster의 자연 병원 체로 DCV 호스트 바이러스 상호 작용 및 공동 진화28동안 호스트 생리, 행동 및 기저 면역 반응을 공부 하기 적합 한 바이러스로 간주 됩니다. 또한, 야생 타입 파리에 감염을 따르는 그것의 급속 한 사망 율은 DCV 유용 하다 저항 또는 취약 유전자에 대 한 화면을 호스트29에.

그러나 초파리에 있는 바이러스 성 감염을 공부 하는 때, 관심사의 여러 측면 있다. 예를 들어 공생 박테리아 Wolbachia 초파리 와 모기30,,3132에서 RNA 바이러스 확산의 넓은 스펙트럼을 억제 하는 기능이 있다. 최근의 증거는 Wolbachia 블록 Sindbis 바이러스 (SINV) 감염에는 upregulation 통해 methyltransferase 호스트33Mt2 식의 가능한 메커니즘을 보여 줍니다. 또한, 곤충의 유전적 배경과 바이러스 감염에 대 한 중요 한 이기도합니다. 유전자, pastrel (태평양 표준시), 자연 다형성 초파리34,35, DCV 감염 자화 율을 결정 하는 예를 들어, 동안 Ubc-E2H CG8492 의 loci 크리켓 마비 바이러스 (CrPV)와 무리 집 바이러스 (FHV) 감염, 각각36에서 포함 된다.

파리, 바이러스-호스트 상호 작용을 설정 하는 특정 방법 초파리 셀 라인37,38, 구두에 호스트 세포 구성 요소에 대 한 높은 처리 화면 등 연구 목적에 따라 선택 되어야 한다 감염 창 자 관련 항 바이러스 응답22,39,40,41,42 또는 나노 사출 상피 장벽을 조직의 면역 자극을 전달 하 여 찌르는 바늘을 공부 하 응답 합니다. 나노 사출 정확 하 게 제어할 수 유도 제어 항 바이러스 반응 및 생리 적인 병 변43, 바이러스 성 복용량 높은 실험 재현성44따라서 보장. 이 연구에서 우리는 초파리, 파리 배경 효과의 중요성을 강조에서 바이러스-호스트 상호 작용을 공부 하는 나노 사출 방법을 설명 합니다.

Protocol

참고: 시작 하기 전에 실험, 셀 라인 및 사용 하는 비행 주식 해야 하지 오염 특히 DCV, FHV, 초파리 X 바이러스 (DXV), 및 조류 신장 염 바이러스 (ANV) 바이러스에 대 한 다른 병원 균에 의해. 이상적으로, RNA 시퀀싱 또는 간단 하 게 PCR 기반 식별 오염10,45를 감지 하는 데 사용 됩니다. 오염 발생, 세포 선 및 비행 주식 사용할 수 없을 때까지 더 이상<sup class="xref…

Representative Results

이 섹션의 결과 후에 D. melanogaster의 DCV 감염 얻을 수 있습니다. 그림 1 초파리에 있는 바이러스 성 감염의 플로우 차트를 보여 줍니다. 파리 intra-thoracically, 주입 하 고 샘플 바이러스 TCID50 와 게놈 RNA 수준 (그림 1)의 측정을 위해 수집 됩니다. 바이러스 감염 세포 세포의 용 해를 일으킬 수 있다 고 CPE 3 일 게시물 감염 (그림 2A)에서 관찰 된?…

Discussion

이 문서에서는, 선물이 상세한 절차 성인 초파리 melanogaster 에 바이러스 감염 시스템을 설정 하는 방법에 나노 분사를 사용 하 여. 프로토콜에 적절 한 플라이 라인 및 바이러스 주식, 감염, 전염 성 지표의 평가 기술과 항 바이러스 응답의 측정의 준비 포함 됩니다. DCV는 바이러스 성 병원 체의 예제로 사용 하 고, 바이러스의 다른 종류의 수만 성공적으로 적용 되었을 연구에 대 한 초파리 시…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 전체 팬 연구소 IPS에 감사 하 고 싶습니다. CA입니다. 우리는 의견에 대 한 실험적인 지원 및 박사 Gonalo 코르도바 Steger (Springer 자연), 박사 제시카 바 가스 (IPS, 파리), 박사 생 주 (IPS, 파리) 박사 Lanfeng 왕 (IPS, CA)을 감사합니다. 이 작품은 L.P (XDA13010500) 및 H.T (XDB29030300), L.P (31870887 및 31570897) 및 J.Y (31670909)을 중국의 국가 자연과학 기초 과학의 중국 아카데미의 전략적 우선 순위 연구 프로그램에서 교부 금에 의해 지원 되었다. L.P은 CAS 청소년 혁신 진흥 협회 (2012083)의 연구원 이다.

Materials

0.22um filter Millipore SLGP033RS
1.5 ml Microcentrifuge tubes Brand 352070
1.5 ml RNase free Microcentrifuge tubes Axygen MCT-150-C
10 cm cell culture dish Sigma CLS430167 Cell culture
100 Replacement tubes Drummond Scientific 3-000-203-G/X
15 ml tube Corning 352096
ABI 7500 qPCR system ABI 7500 qPCR
Cell Incubator Sanyo MIR-553
Centriguge Eppendof 5810R
Centriguge Eppendof 5424R
Chloroform Sigma 151858 RNA extraction
DEPC water Sigma 95284-100ML RNA extraction
Drosophila Incubator Percival I-41NL Rearing Drosophila
FBS Invitrogen 12657-029 Cell culture
flat bottom 96-well-plate Sigma CLS3922 Cell culture
Fluorescence microscope Olympus DP73
Isopropyl alcohol Sigma I9516 RNA extraction
Lysis buffer (RNA extraction) Thermo Fisher 15596026 TRIzol Reagent
Lysis buffer (liquid sample RNA extraction) Thermo Fisher 10296028 TRIzol LS Reagent
Microscope Olympus CKX41
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector Drummond Scientific 3-000-204 Nanoject II Variable Volume (2.3 to 69 nL) Automatic Injector with Glass Capillaries (110V)
Optical Adhesive Film ABI 4360954 qPCR
Penicillin-Streptomycin, Liquid Invitrogen 15140-122 Cell culture
qPCR plate ABI A32811 qPCR
Schneider’s Insect Medium Sigma S9895 Cell culture
statistical software GraphPad Prism 7
TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix TransScript AT301 RNA extraction
Vortex IKA VORTEX 3 RNA extraction

Riferimenti

  1. Rahim, M. A., Uddin, K. N. Chikungunya: an emerging viral infection with varied clinical presentations in Bangladesh: Reports of seven cases. BMC Research Notes. 10, 410 (2017).
  2. Douam, F., Ploss, A. Yellow Fever Virus: Knowledge Gaps Impeding the Fight Against an Old Foe. Trends in Microbiology. , (2018).
  3. Santiago, G. A., et al. Performance of the Trioplex real-time RT-PCR assay for detection of Zika, dengue, and chikungunya viruses. Nature Communications. 9. 9, 1391 (2018).
  4. Gould, E., Pettersson, J., Higgs, S., Charrel, R., de Lamballerie, X. Emerging arboviruses: Why today?. One Health. 4, 1-13 (2017).
  5. Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
  6. Xu, J., Cherry, S. Viruses and antiviral immunity in Drosophila. Developmental & Comparative Immunology. 42, 67-84 (2014).
  7. Shirinian, M., et al. A Transgenic Drosophila melanogaster Model To Study Human T-Lymphotropic Virus Oncoprotein Tax-1-Driven Transformation In Vivo. Journal of Virology. 89, 8092-8095 (2015).
  8. Adamson, A. L., Chohan, K., Swenson, J., LaJeunesse, D. A Drosophila model for genetic analysis of influenza viral/host interactions. Genetica. 189, 495-506 (2011).
  9. Hao, L., et al. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454, 890-893 (2008).
  10. Webster, C. L., et al. The Discovery, Distribution, and Evolution of Viruses Associated with Drosophila melanogaster. Plos Biology. 13, e1002210 (2015).
  11. Heigwer, F., Port, F., Boutros, M. RNA Interference (RNAi) Screening in Drosophila. Genetica. 208, 853-874 (2018).
  12. West, C., Silverman, N. p38b and JAK-STAT signaling protect against Invertebrate iridescent virus 6 infection in Drosophila. PLOS Pathogens. 14, e1007020 (2018).
  13. Liu, Y., et al. STING-Dependent Autophagy Restricts Zika Virus Infection in the Drosophila Brain. Cell Host & Microbe. 24, 57-68 (2018).
  14. Wang, X. H., et al. RNA interference directs innate immunity against viruses in adult Drosophila. Science. 312, 452-454 (2006).
  15. van Rij, R. P., et al. The RNA silencing endonuclease Argonaute 2 mediates specific antiviral immunity in Drosophila melanogaster. Genes & Development. 20, 2985-2995 (2006).
  16. Deddouche, S., et al. The DExD/H-box helicase Dicer-2 mediates the induction of antiviral activity in drosophila. Nature Immunology. 9, 1425-1432 (2008).
  17. Chotkowski, H. L., et al. West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response. Virology. 377, 197-206 (2008).
  18. Paradkar, P. N., Trinidad, L., Voysey, R., Duchemin, J. B., Walker, P. J. Secreted Vago restricts West Nile virus infection in Culex mosquito cells by activating the Jak-STAT pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 18915-18920 (2012).
  19. Souza-Neto, J. A., Sim, S., Dimopoulos, G. An evolutionary conserved function of the JAK-STAT pathway in anti-dengue defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17841-17846 (2009).
  20. Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 7257-7262 (2005).
  21. Costa, A., Jan, E., Sarnow, P., Schneider, D. The Imd pathway is involved in antiviral immune responses in Drosophila. PLoS One. 4, e7436 (2009).
  22. Ferreira, A. G., et al. The Toll-dorsal pathway is required for resistance to viral oral infection in Drosophila. PLOS Pathogens. 10, e1004507 (2014).
  23. Moy, R. H., et al. Antiviral autophagy restrictsRift Valley fever virus infection and is conserved from flies to mammals. Immunity. 40, 51-65 (2014).
  24. Shelly, S., Lukinova, N., Bambina, S., Berman, A., Cherry, S. Autophagy is an essential component of Drosophila immunity against vesicular stomatitis virus. Immunity. 30, 588-598 (2009).
  25. Bronkhorst, A. W., et al. The DNA virus Invertebrate iridescent virus 6 is a target of the Drosophila RNAi machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E3604-E3613 (2012).
  26. Palmer, W. H., Medd, N. C., Beard, P. M., Obbard, D. J. Isolation of a natural DNA virus of Drosophila melanogaster, and characterisation of host resistance and immune responses. PLOS Pathogens. 14, e1007050 (2018).
  27. Jousset, F. X., Bergoin, M., Revet, B. Characterization of the Drosophila C virus. Journal of General Virology. 34, 269-283 (1977).
  28. Gupta, V., Stewart, C. O., Rund, S. S. C., Monteith, K., Vale, P. F. Costs and benefits of sublethal Drosophila C virus infection. J Evol Biol. 30, 1325-1335 (2017).
  29. Yang, S., et al. Bub1 Facilitates Virus Entry through Endocytosis in a Model of Drosophila Pathogenesis. Journal of Virology. , (2018).
  30. Teixeira, L., Ferreira, A., Ashburner, M. The bacterial symbiont Wolbachia induces resistance to RNA viral infections in Drosophila melanogaster. Plos Biology. 6, e2 (2008).
  31. Ferguson, N. M., et al. Modeling the impact on virus transmission of Wolbachia-mediated blocking of dengue virus infection of Aedes aegypti. Science Translational Medicine. 7, 279ra237 (2015).
  32. Hedges, L. M., Brownlie, J. C., O’Neill, S. L., Johnson, K. N. Wolbachia and virus protection in insects. Science. 322, 702 (2008).
  33. Bhattacharya, T., Newton, I. L. G., Hardy, R. W. Wolbachia elevates host methyltransferase expression to block an RNA virus early during infection. PLOS Pathogens. 13, e1006427 (2017).
  34. Magwire, M. M., et al. Genome-wide association studies reveal a simple genetic basis of resistance to naturally coevolving viruses in Drosophila melanogaster. PLOS Genetics. 8, e1003057 (2012).
  35. Cao, C., Cogni, R., Barbier, V., Jiggins, F. M. Complex Coding and Regulatory Polymorphisms in a Restriction Factor Determine the Susceptibility of Drosophila to Viral Infection. Genetica. , 2159-2173 (2017).
  36. Martins, N. E., et al. Host adaptation to viruses relies on few genes with different cross-resistance properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5938-5943 (2014).
  37. Moser, T. S., Sabin, L. R., Cherry, S. RNAi screening for host factors involved in Vaccinia virus infection using Drosophila cells. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
  38. Zhu, F., Ding, H., Zhu, B. Transcriptional profiling of Drosophila S2 cells in early response to Drosophila C virus. Journal of Virology. 10, 210 (2013).
  39. Ekstrom, J. O., Hultmark, D. A Novel Strategy for Live Detection of Viral Infection in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 6, 26250 (2016).
  40. Durdevic, Z., et al. Efficient RNA virus control in Drosophila requires the RNA methyltransferase Dnmt2. EMBO Reports. 14, 269-275 (2013).
  41. Chrostek, E., et al. Wolbachia variants induce differential protection to viruses in Drosophila melanogaster: a phenotypic and phylogenomic analysis. PLOS Genetics. 9, e1003896 (2013).
  42. Gupta, V., Vale, P. F. Nonlinear disease tolerance curves reveal distinct components of host responses to viral infection. Royal Society Open Science. 4, 170342 (2017).
  43. Chtarbanova, S., et al. Drosophila C virus systemic infection leads to intestinal obstruction. Journal of Virology. 88, 14057-14069 (2014).
  44. Merkling, S. H., van Rij, R. P. Analysis of resistance and tolerance to virus infection in Drosophila. Nature Protocols. 10, 1084-1097 (2015).
  45. Goic, B., et al. RNA-mediated interference and reverse transcription control the persistence of RNA viruses in the insect model Drosophila. Nature Immunology. 14, 396-403 (2013).
  46. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2011).
  47. . Biochemical and Biophysical Research Communications: 1991 index issue. Cumulative indexes for volumes 174-181. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 1-179 (1991).
  48. Cotarelo, M., et al. Cytopathic effect inhibition assay for determining the in-vitro susceptibility of herpes simplex virus to antiviral agents. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 44, 705-708 (1999).
  49. Reed, L. J. M., H, A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
  50. Khalil, S., Jacobson, E., Chambers, M. C., Lazzaro, B. P. Systemic bacterial infection and immune defense phenotypes in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. , e52613 (2015).
  51. Schwenke, R. A., Lazzaro, B. P. Juvenile Hormone Suppresses Resistance to Infection in Mated Female Drosophila melanogaster. Current Biology. 27, 596-601 (2017).
  52. Sabin, L. R., Hanna, S. L., Cherry, S. Innate antiviral immunity in Drosophila. Current opinion in immunology. 22, 4-9 (2010).
  53. Yin, J., Zhang, X. X., Wu, B., Xian, Q. Metagenomic insights into tetracycline effects on microbial community and antibiotic resistance of mouse gut. Ecotoxicology. 24, 2125-2132 (2015).

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Citazione di questo articolo
Yang, S., Zhao, Y., Yu, J., Fan, Z., Gong, S., Tang, H., Pan, L. Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (145), e58845, doi:10.3791/58845 (2019).

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