הקמתה של זיהום נגיפי וניתוח של התערבות מארח-וירוס דרוזופילה Melanogaster
Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד להקים זיהום ויראלי ויוו דרוזופילה melanogaster באמצעות שיטת ננו-הזרקת טכניקות בסיסיות כדי לנתח וירוס-פונדקאי אינטראקציה.
Abstract
וירוס מפיצים הוא הגורם העיקרי במחלות מדבקות. לפיכך, להבין את האינטראקציה בין הוירוס המארח הוא מאוד חשוב להרחיב את הידע שלנו על מניעה וטיפול של זיהום ויראלי. זבוב הפירות melan דרוזופילהogaster הוכיחה להיות אחד האורגניזמים מודל פורה ויעיל ביותר המסך עבור גורמים אנטי ויראליים ולחקור אינטראקציה וירוס-מארח, בשל כלים גנטית חזקים מאוד שנשמרת חיסונית מולדת איתות המסלולים. ההליך המתואר כאן מדגים שיטת ננו-הזרקת ליצור זיהום נגיפי, זירוז תגובות אנטי מערכתית של הזבוב הבוגר. שליטה מדויקת של המינון הזרקת ויראלי בשיטה זו מאפשר הפארמצבטית ניסויית גבוהה. הפרוטוקולים המתוארים במחקר זה כוללים את ההכנה של זבובים, הווירוס, בשיטת הזרקה, ניתוח שיעור הישרדות, המדידה עומס וירוס הערכה מסלול אנטי ויראליים. ההשפעות ההשפעה של זיהום נגיפי מאת רקע הזבובים שהוזכרו כאן. שיטה זו דלקת היא קלה לביצוע, הדיר באופן כמותי; זה יכול להיות מיושם על המסך עבור המחשב המארח/ויראלי הגורמים המעורבים באינטראקציה וירוס-מארח, לנתח crosstalk בין החיסון מולדים איתות מסלולים ביולוגיים אחרים בתגובה זיהום ויראלי.
Introduction
מתעוררים זיהומים נגיפיים, במיוחד על-ידי arboviruses, כגון וירוס Chikungunya1, נגיף דנגי, קדחת צהובה וירוס2 ו-וירוסZika3, כבר היוו איום על בריאות הציבור על-ידי גרימת מגיפות 4. לפיכך, הבנה טובה יותר של וירוס-פונדקאי אינטראקציה הפך להיות חשוב יותר ויותר שליטה מגיפה וטיפול מחלות ויראליות אצל בני אדם. עבור מטרה זו, חייב להקים מודלים מתאימים ויעילים יותר לחקור את המנגנונים בנגיף.
זבוב הפירות, Drosophilamelanogaster (melanogaster ד), מספקת מערכת חזקה לחקור וירוס-פונדקאי אינטראקציה5,6 , הוכיחה להיות אחד המודלים היעילה ביותר לחקר מחלות ויראליות האדם7 , 8 , 9. נגיפים מאוד שנשמרת איתות משעולים, האחד והיחיד כלים גנטיים לגרום זבובים מודל לייצר תוצאות משמעותיות עם השלכות אמיתי לחקר נגיפים אנושיים. בנוסף, זבובים הם קלה וזולה לשמור על מעבדה, והם נוחים להקרנה בקנה מידה גדול של גורמים רגולטוריים הרומן6,10 הנגיף, המארח במהלך זיהום.
ארבע הגדולות מאוד שנשמרת מסלולים אנטי ויראליים (למשל., ה RNA מסלול של הפרעה (RNAi)11, מסלול JAK-STAT12, מסלול NF-κB ולאחר מסלול autophagy13) נלמדים גם בדרוזופילה האחרונים שנה6. מסלול RNAi היא מנגנון אנטי-ויראלי רחב יכול לדכא את רוב סוגי וירוס זיהום6,14. הפרעה של מסלול זה על ידי מוטציה בגנים כמו מקצץ-2 (Dcr-2) או Argonaute 2 (AGO2) יכול להוביל וירוס מוגברת כייל נוגדנים ומנחה התמותה15,16,17. הנתיב JAK-STAT היה מעורב השליטה זיהום על ידי וירוס של משפחת Dicistroviridae ומשפחת Flaviviridae בחרקים, למשל., וירוס דרוזופילה C (DCV) זבובים16 ו וירוס הנילוס המערבי (WNV) וירוס דנגה יתושים18,19. אגרה דרוזופילה (הומולוגי ל מסלול NF-κB אנושי) חיסוני (IMD) מסלולים (בדומה מסלול NF-κB ו- TNF אנושי) הן מעורב מגן וירוס הפלישה20,21, 22. autophagy הוא במנגנון שנשמרת אחר מעורב ברגולציה של זיהום ויראלי, אשר מאופיין היטב דרוזופילה23,24. לפיכך, זיהוי גורמים רגולטוריים הרומן של מסלולים אלה ויבתר crosstalk בין אלה איתות נגיפים ועוד מסלולים ביולוגיים, כגון חילוף החומרים, הזדקנות, התגובה העצבית וכן הלאה, ניתן בקלות להגדיר ב- דרוזופילה מערכת.
למרות ביותר ומבוססת במודלים דרוזופילה זיהומיות ויראליות הם המושרה על ידי RNA וירוסים, זיהום על ידי 6I וירוס ססגוני הגעה (IV-6) וירוסים קליתיאה (kallithea) הראו הפוטנציאל ללימוד הווירוסים DNA זבובים25, 26. יתר על כן, ניתן לשנות את הנגיף גם כדי לאפשר זיהום של דרוזופילה, כגון וירוס שפעת9. זה התרחב באופן משמעותי את היישום של פלטפורמת הסינון דרוזופילה . בהליך זה, אנו משתמשים DCV כדוגמה כדי לתאר כיצד לפתח מערכת זיהומיות ויראליות דרוזופילה. DCV הוא חיובי-סנס נטושים RNA שוירוס יחיד של נוקלאוטידים כ 9300, קידוד חלבונים 927. בתור חיידק הטבעי של melanogaster ד, DCV נחשב כמו וירוס מתאים ללמוד התגובה החיסונית פיזיולוגיים, התנהגותי, הבסיס מארח במהלך אינטראקציה והתפתחות משותף מארח-וירוס28. בנוסף, שיעור התמותה המהירה שלה בעקבות זיהום פראי סוג בזבובים הופכת DCV שימושי עבור גנים עמיד או רגישים מסך מארח29.
עם זאת, ישנם מספר היבטים של דאגה כשלמדתי זיהומים נגיפיים ב דרוזופילה. לדוגמה, חיידקים סימביוטיים Wolbachia יש את היכולת לעכב את ספקטרום רחב של התפשטות וירוס רנ א ב דרוזופילה וכילה נגד יתושים30,31,32. הראיות זה התבצעה מציגה את מנגנון אפשרי אשר Wolbachia רחובות Sindbis (SINV) בנגיף דרך קולטנים upregulation של methyltransferase Mt2 ביטוי מארח33. בנוסף, הרקע הגנטי של חרקים גם הוא קריטי עבור זיהום ויראלי. למשל, פולימורפיזם טבעי בגן, pastrel (pst), קובעת את הרגישות לזיהום DCV דרוזופילה34,35, בעוד מנחלת Ubc-E2H ו- CG8492 מעורבים קריקט שיתוק וירוס (CrPV) ואת הצאן הבית זיהום בנגיף (FHV), בהתאמה36.
הדרכים מסוים להקים את האינטראקציה וירוס-פונדקאי בזבובים, להיבחר על-פי מחקר למטרות כגון מסך תפוקה גבוהה עבור מרכיבי התא המארח דרוזופילה תא קווים37,38, אוראלי זיהום ללמוד תגובה אנטי-ויראלי ספציפי בטן22,39,40, המחט חירור41,42 או ננו-הזרקת על-ידי העברת אפיתל מחסומים כדי לעורר החיסונית מערכתית תגובות. ננו-הזרקת בדיוק יכול לשלוט המינון ויראלית כדי לגרום תגובה אנטי ויראליים מבוקרת, הנגע פיזיולוגיים43, ומבטיח הפארמצבטית ניסויית גבוהה44. במחקר זה, אנו מתארים שיטה ננו-הזרקת ללמוד אינטראקציות וירוס-מארח דרוזופילה, הדגשת חשיבות תופעות רקע הזבובים.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה, נציג הליך מפורט על איך להקים מערכת זיהומיות ויראליות למבוגרים דרוזופילה melanogaster באמצעות ננו-הזרקה. הפרוטוקולים כוללים את הכנת קווים לטוס המתאים ואת וירוס מניות, זיהום, ההערכה זיהומיות האינדיקטורים וטכניקות המדידה של התגובה אנטי ויראליים. למרות DCV משמש כדוגמה חיידק ויראלי, ע?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות את כל המעבדה פאן IPS. רשויות אישורים. אנו מודים ד ר וואנג Lanfeng (IPS, CAS) על סיוע ניסיוני, ד ר Gonalo קורדובה סטגר (ספרינגר הטבע), ד ר ג’סיקה ורגס (IPS, פריז), ד ר ז’ו סנג (IPS, פריז) להערות. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהתוכנית האסטרטגית עדיפות מחקר של האקדמיה הסינית למדעים L.P (XDA13010500) או מלאה (XDB29030300), הלאומי מדעי הטבע קרן של סין L.P (31870887 ו- 31570897), J.Y (31670909). L.P הוא עמית CAS הנוער חדשנות קידום האגודה (2012083).
Materials
| 0.22um filter | Millipore | SLGP033RS | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Brand | 352070 | |
| 1.5 ml RNase free Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm cell culture dish | Sigma | CLS430167 | Cell culture |
| 100 Replacement tubes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| 15 ml tube | Corning | 352096 | |
| ABI 7500 qPCR system | ABI | 7500 | qPCR |
| Cell Incubator | Sanyo | MIR-553 | |
| Centriguge | Eppendof | 5810R | |
| Centriguge | Eppendof | 5424R | |
| Chloroform | Sigma | 151858 | RNA extraction |
| DEPC water | Sigma | 95284-100ML | RNA extraction |
| Drosophila Incubator | Percival | I-41NL | Rearing Drosophila |
| FBS | Invitrogen | 12657-029 | Cell culture |
| flat bottom 96-well-plate | Sigma | CLS3922 | Cell culture |
| Fluorescence microscope | Olympus | DP73 | |
| Isopropyl alcohol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
| Lysis buffer (RNA extraction) | Thermo Fisher | 15596026 | TRIzol Reagent |
| Lysis buffer (liquid sample RNA extraction) | Thermo Fisher | 10296028 | TRIzol LS Reagent |
| Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | Nanoject II Variable Volume (2.3 to 69 nL) Automatic Injector with Glass Capillaries (110V) |
| Optical Adhesive Film | ABI | 4360954 | qPCR |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
| qPCR plate | ABI | A32811 | qPCR |
| Schneider’s Insect Medium | Sigma | S9895 | Cell culture |
| statistical software | GraphPad Prism 7 | ||
| TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix | TransScript | AT301 | RNA extraction |
| Vortex | IKA | VORTEX 3 | RNA extraction |
Riferimenti
- Rahim, M. A., Uddin, K. N. Chikungunya: an emerging viral infection with varied clinical presentations in Bangladesh: Reports of seven cases. BMC Research Notes. 10, 410 (2017).
- Douam, F., Ploss, A. Yellow Fever Virus: Knowledge Gaps Impeding the Fight Against an Old Foe. Trends in Microbiology. , (2018).
- Santiago, G. A., et al. Performance of the Trioplex real-time RT-PCR assay for detection of Zika, dengue, and chikungunya viruses. Nature Communications. 9. 9, 1391 (2018).
- Gould, E., Pettersson, J., Higgs, S., Charrel, R., de Lamballerie, X. Emerging arboviruses: Why today?. One Health. 4, 1-13 (2017).
- Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
- Xu, J., Cherry, S. Viruses and antiviral immunity in Drosophila. Developmental & Comparative Immunology. 42, 67-84 (2014).
- Shirinian, M., et al. A Transgenic Drosophila melanogaster Model To Study Human T-Lymphotropic Virus Oncoprotein Tax-1-Driven Transformation In Vivo. Journal of Virology. 89, 8092-8095 (2015).
- Adamson, A. L., Chohan, K., Swenson, J., LaJeunesse, D. A Drosophila model for genetic analysis of influenza viral/host interactions. Genetica. 189, 495-506 (2011).
- Hao, L., et al. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454, 890-893 (2008).
- Webster, C. L., et al. The Discovery, Distribution, and Evolution of Viruses Associated with Drosophila melanogaster. Plos Biology. 13, e1002210 (2015).
- Heigwer, F., Port, F., Boutros, M. RNA Interference (RNAi) Screening in Drosophila. Genetica. 208, 853-874 (2018).
- West, C., Silverman, N. p38b and JAK-STAT signaling protect against Invertebrate iridescent virus 6 infection in Drosophila. PLOS Pathogens. 14, e1007020 (2018).
- Liu, Y., et al. STING-Dependent Autophagy Restricts Zika Virus Infection in the Drosophila Brain. Cell Host & Microbe. 24, 57-68 (2018).
- Wang, X. H., et al. RNA interference directs innate immunity against viruses in adult Drosophila. Science. 312, 452-454 (2006).
- van Rij, R. P., et al. The RNA silencing endonuclease Argonaute 2 mediates specific antiviral immunity in Drosophila melanogaster. Genes & Development. 20, 2985-2995 (2006).
- Deddouche, S., et al. The DExD/H-box helicase Dicer-2 mediates the induction of antiviral activity in drosophila. Nature Immunology. 9, 1425-1432 (2008).
- Chotkowski, H. L., et al. West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response. Virology. 377, 197-206 (2008).
- Paradkar, P. N., Trinidad, L., Voysey, R., Duchemin, J. B., Walker, P. J. Secreted Vago restricts West Nile virus infection in Culex mosquito cells by activating the Jak-STAT pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 18915-18920 (2012).
- Souza-Neto, J. A., Sim, S., Dimopoulos, G. An evolutionary conserved function of the JAK-STAT pathway in anti-dengue defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17841-17846 (2009).
- Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 7257-7262 (2005).
- Costa, A., Jan, E., Sarnow, P., Schneider, D. The Imd pathway is involved in antiviral immune responses in Drosophila. PLoS One. 4, e7436 (2009).
- Ferreira, A. G., et al. The Toll-dorsal pathway is required for resistance to viral oral infection in Drosophila. PLOS Pathogens. 10, e1004507 (2014).
- Moy, R. H., et al. Antiviral autophagy restrictsRift Valley fever virus infection and is conserved from flies to mammals. Immunity. 40, 51-65 (2014).
- Shelly, S., Lukinova, N., Bambina, S., Berman, A., Cherry, S. Autophagy is an essential component of Drosophila immunity against vesicular stomatitis virus. Immunity. 30, 588-598 (2009).
- Bronkhorst, A. W., et al. The DNA virus Invertebrate iridescent virus 6 is a target of the Drosophila RNAi machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E3604-E3613 (2012).
- Palmer, W. H., Medd, N. C., Beard, P. M., Obbard, D. J. Isolation of a natural DNA virus of Drosophila melanogaster, and characterisation of host resistance and immune responses. PLOS Pathogens. 14, e1007050 (2018).
- Jousset, F. X., Bergoin, M., Revet, B. Characterization of the Drosophila C virus. Journal of General Virology. 34, 269-283 (1977).
- Gupta, V., Stewart, C. O., Rund, S. S. C., Monteith, K., Vale, P. F. Costs and benefits of sublethal Drosophila C virus infection. J Evol Biol. 30, 1325-1335 (2017).
- Yang, S., et al. Bub1 Facilitates Virus Entry through Endocytosis in a Model of Drosophila Pathogenesis. Journal of Virology. , (2018).
- Teixeira, L., Ferreira, A., Ashburner, M. The bacterial symbiont Wolbachia induces resistance to RNA viral infections in Drosophila melanogaster. Plos Biology. 6, e2 (2008).
- Ferguson, N. M., et al. Modeling the impact on virus transmission of Wolbachia-mediated blocking of dengue virus infection of Aedes aegypti. Science Translational Medicine. 7, 279ra237 (2015).
- Hedges, L. M., Brownlie, J. C., O’Neill, S. L., Johnson, K. N. Wolbachia and virus protection in insects. Science. 322, 702 (2008).
- Bhattacharya, T., Newton, I. L. G., Hardy, R. W. Wolbachia elevates host methyltransferase expression to block an RNA virus early during infection. PLOS Pathogens. 13, e1006427 (2017).
- Magwire, M. M., et al. Genome-wide association studies reveal a simple genetic basis of resistance to naturally coevolving viruses in Drosophila melanogaster. PLOS Genetics. 8, e1003057 (2012).
- Cao, C., Cogni, R., Barbier, V., Jiggins, F. M. Complex Coding and Regulatory Polymorphisms in a Restriction Factor Determine the Susceptibility of Drosophila to Viral Infection. Genetica. , 2159-2173 (2017).
- Martins, N. E., et al. Host adaptation to viruses relies on few genes with different cross-resistance properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5938-5943 (2014).
- Moser, T. S., Sabin, L. R., Cherry, S. RNAi screening for host factors involved in Vaccinia virus infection using Drosophila cells. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Zhu, F., Ding, H., Zhu, B. Transcriptional profiling of Drosophila S2 cells in early response to Drosophila C virus. Journal of Virology. 10, 210 (2013).
- Ekstrom, J. O., Hultmark, D. A Novel Strategy for Live Detection of Viral Infection in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 6, 26250 (2016).
- Durdevic, Z., et al. Efficient RNA virus control in Drosophila requires the RNA methyltransferase Dnmt2. EMBO Reports. 14, 269-275 (2013).
- Chrostek, E., et al. Wolbachia variants induce differential protection to viruses in Drosophila melanogaster: a phenotypic and phylogenomic analysis. PLOS Genetics. 9, e1003896 (2013).
- Gupta, V., Vale, P. F. Nonlinear disease tolerance curves reveal distinct components of host responses to viral infection. Royal Society Open Science. 4, 170342 (2017).
- Chtarbanova, S., et al. Drosophila C virus systemic infection leads to intestinal obstruction. Journal of Virology. 88, 14057-14069 (2014).
- Merkling, S. H., van Rij, R. P. Analysis of resistance and tolerance to virus infection in Drosophila. Nature Protocols. 10, 1084-1097 (2015).
- Goic, B., et al. RNA-mediated interference and reverse transcription control the persistence of RNA viruses in the insect model Drosophila. Nature Immunology. 14, 396-403 (2013).
- Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2011).
- . Biochemical and Biophysical Research Communications: 1991 index issue. Cumulative indexes for volumes 174-181. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 1-179 (1991).
- Cotarelo, M., et al. Cytopathic effect inhibition assay for determining the in-vitro susceptibility of herpes simplex virus to antiviral agents. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 44, 705-708 (1999).
- Reed, L. J. M., H, A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
- Khalil, S., Jacobson, E., Chambers, M. C., Lazzaro, B. P. Systemic bacterial infection and immune defense phenotypes in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. , e52613 (2015).
- Schwenke, R. A., Lazzaro, B. P. Juvenile Hormone Suppresses Resistance to Infection in Mated Female Drosophila melanogaster. Current Biology. 27, 596-601 (2017).
- Sabin, L. R., Hanna, S. L., Cherry, S. Innate antiviral immunity in Drosophila. Current opinion in immunology. 22, 4-9 (2010).
- Yin, J., Zhang, X. X., Wu, B., Xian, Q. Metagenomic insights into tetracycline effects on microbial community and antibiotic resistance of mouse gut. Ecotoxicology. 24, 2125-2132 (2015).
