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Ricerca sul cancro

Détection en temps réel de dans l’apoptose des cellules tumorales in Vitro induite par CD8+ T Cells pour étudier les fonctions immunitaires de suppresseurs de tumeur-infiltration de cellules myéloïdes

Published: January 29, 2019
doi:
10.3791/58841
, , ,
1Royal (Dick) School of Veterinary Studies and Roslin Institute,University of Edinburgh, 2MRC Centre for Reproductive Health,University of Edinburgh, 3Edinburgh Phenotypic Assay Centre,University of Edinburgh, 4Cancer Research UK Edinburgh Centre, MRC Institute of Genetics, Molecular Medicine,University of Edinburgh

Summary

Nous décrivons ici un protocole afin d’étudier la cytotoxicité des CD8 pré-activé+ T les cellules contre les cellules cancéreuses en détectant l’apoptose cancer cellules via en temps réel la microscopie. Ce protocole peut enquêter sur les mécanismes à l’origine myéloïde cellulaire induite par des lymphocytes T suppression et évaluer composés visant à reconstituer T cellules via blocus des cellules myéloïdes suppresseurs immunitaires.

Abstract

Potentialisation de la capacité de tumeur-massacre des CD8+ T les cellules des tumeurs, ainsi que de leur infiltration tumorale efficace, est un élément clé du succès immunothérapies. Plusieurs études ont montré que les cellules myéloïdes infiltrantes de tumeur (par exemple, les cellules myéloïdes dérivés suppresseur (MDSCs) et macrophages associées à la tumeur (EAPV)) suppriment cytotoxicité des CD8+ T des cellules dans le microenvironnement tumoral et ce ciblage ces cellules myéloïdes réglementaires peuvent améliorer les immunothérapies. Nous présentons ici un système de test in vitro pour évaluer les effets suppressifs immunitaires monocytaire-MDSCs et TAMs sur la capacité de tumeur-massacre des CD8+ T des cellules. À cette fin, nous avons cultivé tout d’abord naïve splénique CD8+ T cellules avec les activant anticorps anti-CD3/CD28 en présence ou en absence de cellules suppressives et puis conjointement mis en culture les cellules T pré-activé avec cibler les cellules cancéreuses en présence d’un fluorogène substrat de caspase-3. Fluorescence du substrat dans les cellules cancéreuses a été détectée par microscopie de fluorescence en temps réel comme un indicateur de l’apoptose des cellules tumorales de lymphocytes induite. Dans cet essai, nous pouvons détecter avec succès l’augmentation de l’apoptose des cellules tumorales par CD8+ T les cellules et sa répression par pré-culture avec TAMs ou MDSCs. Cette analyse fonctionnelle est utile pour l’étude des CD8+ T cell des mécanismes de répression par des cellules myéloïdes réglementaires et identification de cibles thérapeutiques pour la surmonter par l’intermédiaire de criblage à haut débit.

Introduction

Il est connu que CD8+ T cellules peuvent d’éliminer les cellules tumorales lorsqu’elles exercent leur cytotoxicité complet. Après l’activation du récepteur des lymphocytes T (TCR), CD8+ T les cellules prolifèrent et se différencient en cellules effectrices cytotoxiques. Le CD8 activés et élargie+ T cellules sécrètent des granules cytotoxiques, y compris la perforine et granzymes, qui sont transférés dans des cellules cibles et initient diverses voies lytiques comme caspase-3 médiée par apoptose1. CD8+ T cellules peuvent également induire l’apoptose des cellules tumorales en activant les récepteurs sur les cellules cibles, tels que les récepteurs de facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α), premiers apoptosis signal ligand (FasL) ou TNF-related induisant l’apoptose ligand (TRAIL). En outre, les CD8 activés+ T cellules sécrètent l’interféron-γ (IFN-γ) qui peut supprimer la prolifération des cellules tumorales et accroître la sensibilité des cellules tumorales aux CD8+ T des cellules via la régulation de FasL récepteur1. Vu le potentiel de CD8+ T capacité de mise à mort de tumeur, plusieurs stratégies pour stimuler leur cytotoxicité (p. ex., inhibiteurs de point de contrôle, la vaccination du cancer et transfert adoptif du récepteur de l’antigène chimérique (voiture) exprimant des lymphocytes T) ont été établis et illustré d’important effets thérapeutique sur certains types de cancer2. Cependant, accumulant les preuves suggère qu’immunitaires infiltrant-tumeur des cellules comme les lymphocytes T régulateurs, suppresseur myéloïde dérivées des cellules (MDSCs) et macrophages associées à la tumeur (EAPV) peuvent supprimer CD8+ T fonctions des cellules et limitent l’efficacité des immunothérapies3,4,5. Pour améliorer ces immunothérapies, il est important de comprendre la limite de cellules immunitaires comment suppresseurs CD8+ la cytotoxicité des lymphocytes T. L’identification des CD8+ des lymphocytes T des mécanismes de répression ainsi que des cibles thérapeutiques pour la surmonter, il faudra le développement et l’utilisation des essais in vitro.

La méthode de l’étalon-or de mesure CD8+ la cytotoxicité des lymphocytes T est le test de libération de chrome dans lequel la sortie de la sonde radioactive (51Cr), de la cible des cellules qui sont lysées par CD8+ T des cellules, est déterminée6. Cependant, ce dosage a plusieurs inconvénients, notamment une sensibilité relativement faible, ambiants, incapacité à détecter les événements apoptotiques précoces, problèmes d’élimination dangereux et compatibilité limitée avec la manipulation de liquides automatique et détection de soutenir applications de débit plus élevées. Une autre méthode commune est analyses de cytométrie de flux des flux dans lequel l’apoptose des cellules tumorales cible est détectée par annexine V liaison7. Dans ce test, il est possible de détecter d’autres paramètres tels que la mort des cellules cibles à l’aide de l’iodure de propidium (PI) ou 7-aminoactinomycine D (7-AAD) et activation des cellules effectrices indiqué par l’expression CD107a ou CD69, en plus de l’apoptose dans les cellules cibles7 . Toutefois, ce test nécessite un grand nombre de cellules suppressives par rapport à l’essai de version de Chrome. Il exige également le détachement et la ventilation des cellules cibles adhérentes et cela peut fausser les résultats. En effet, le chrome version test ou test de cytométrie en flux ne sont pas couramment utilisés pour étudier les effets sur les cellules sur des fonctions des lymphocytes T suppresseurs. Au lieu de cela, la mesure de la prolifération des lymphocytes T indiquée par dilution d’un colorant fluorescent (p. ex., CFSE) pré-chargés dans les cellules T est fréquemment utilisée pour évaluer l’inhibition des CD8+ la fonction des cellules T par les cellules suppressives. Détection de la production d’IFN-γ provenant des cellules T est une autre méthode standard pour évaluer les effets des cellules suppressives sur l’activation de lymphocytes T8,9. Toutefois, les résultats de ces essais ne correspondent pas nécessairement à la cellule cible, tuant la capacité des CD8+ T des cellules.

Nous présentons ici un autre test fonctionnel afin d’évaluer les effets des cellules suppressives, notamment les macrophages dans les tumeurs métastatiques, sur la cytotoxicité des CD8+ T des cellules. Cette méthode détermine la cytotoxicité des CD8+ T, préalablement cultivées avec ou sans les cellules suppressives en présence d’anticorps anti-CD3/CD28 activation par détection de l’apoptose des cellules tumorales, les cellules indiquent par fluorescence d’un fluorogène caspase-3 substrat à l’aide de6 automatisé time-lapse microscopie (Figure 1). Ce protocole a plusieurs avantages par rapport aux autres méthodes ; Il nécessite seulement un petit nombre de cellules, permet de détecter la mort des cellules tumorales adhérentes à haute sensibilité, peut l’image interaction effecteurs-cible en temps réel et se prête au criblage à haut débit.

Dans ce protocole, métastases associées aux macrophages (SMMA) et leurs ancêtre monocytaire-MDSCs (M-MDSCs) isolés de tumeurs métastatiques chez les souris sont utilisées comme cellules suppressives. Dans des modèles murins de cancer du sein métastatique, une population distincte des macrophages caractérisé comme F4/80hauteLy6G–CD11bhauteLy6Cfaible s’accumule dans le poumon contenant des tumeurs métastatiques. Cette population de macrophage est rarement trouvée dans le poumon normal et donc appelée macrophages associées aux métastases (SMMA)10. Dans ces modèles de souris, un autre myéloïde cellule population, définie aussi F4/80hauteLy6G–CD11bhauteLy6Chaute, aussi s’accumule surtout dans le poumon métastatique où elle donne naissance à SMMA11. Selon leurs caractéristiques, les CD11bhauteLy6Chaute MAM cellules progénitrices pourraient représenter M-MDSCs12.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des souris ont été effectués conformément à une licence permission de UK Home Office (P526C60B3). Informations sur les réactifs commerciaux et équipements sont énumérés dans la Table des matières. 1. préparation des cellules cibles qui expriment la protéine fluorescente rouge dans leurs noyaux Une lignée de cellules de cancer de souris cible provenir d’une source appropriée.Remarque : Dans le présent protocole, un dérivé fortement métastatique de E0771 mouse mammary tumor cellules (E0771-LG)13 sont utilisés. Cellules E0771 parentales proviennent de souris C57BL/614. Décongeler et maintenir un flacon de cellules E0771-LG avec de Dulbecco modifié Eagles (DMEM) dont 10 % (v/v) sérum fœtal (SVF) dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C, humidité de 95 % et 5 % de CO2.NOTE : Il convient de confirmer que les cellules sont négatifs pour les mycoplasmes. À cette fin, la culture des cellules E0771 (ou cellules à tester) pour 2 ou 3 jours comme décrit ci-dessus (en l’absence d’antibiotiques et Antimycotiques), recueillir 500 μl de milieu de culture. Centrifuger le médium à 12 419 x g pendant 60 s pour éliminer les débris cellulaires et transvaser le surnageant dans tubes neufs. Déterminer la contamination de mycoplasmes en utilisant un kit de test disponible dans le commerce de mycoplasma (voir Table des matières) ou PCR15 suivant les instructions du fabricant. Graines de 5 x 103 E0771-LG cellules par puits dans une plaque 12 puits et de la culture, que les cellules avec 10 % (v/v) de SVF-DMEM pendant la nuit dans un incubateur à 37 ° C, humidité de 95 % et 5 % de CO2.Remarque : Si le taux de prolifération des cellules cibles est faible (plus de 36 h de temps de doublement de la population), le nombre de cellules peut être augmenté à 1 x 104. Remplacez le support par 1 mL de 10 % (v/v) de SVF-DMEM, dont 10 μg/mL polybrene et ajouter 25 μL de particules lentivirales (1 x 106 TU/mL) codant un nucléaire limitée protéine fluorescente rouge (mKate2, reportez-vous à la Table des matières). La culture des cellules pendant 24 h dans un incubateur à 37 ° C, humidité de 95 % et 5 % de CO2. Remplacez le support par 10 % (v/v) de SVF-DMEM et culture les cellules pendant 24-48 h dans un incubateur à 37 ° C, humidité de 95 % et 5 % de CO2. Remplacez le support par 10 % (v/v) de SVF-DMEM dont 1 puromycine μg/mL lorsque les cellules commencent à exprimer une protéine fluorescente rouge et de la culture les cellules jusqu’à ce qu’ils soient confluente de 80 à 90 %.NOTE : Concentration de puromycine sera différente entre les types de cellules de cible et doit être optimisée à l’aide de cellules non transfectées. Sous-culture la survie des cellules pour 1 à 3 passages avec 10 % (v/v) de SVF-DMEM dont 1 puromycine μg/mL et cryopréserver des stocks dans un système de stockage d’azote liquide vapeur phase jusqu’à l’utilisation. 2. isolement des cellules de suppresseur de ces tumeurs chez les souris Remarque : Dans ce protocole, cellules suppressives (c.-à-d. SMMA et M-MDSCs) sont isolés du poumon contenant des tumeurs métastatiques, mis en place par les cellules E0771-LG. Conditions de dissociation tissulaire et cellulaire tri doivent être optimisées afin d’isoler les cellules de différents tissus. Injecter des cellules cancéreuses de 1 x 106 (E0771-LG) dans la veine caudale de syngéniques C57BL/6, les souris femelles, 7-10 semaine vieux. Après 14 jours, isoler le poumon contenant des tumeurs métastatiques et préparer des suspensions unicellulaires dans les poumons perfusés par digestion enzymatique comme décrit précédemment11.Remarque : Dans ce protocole, quatre souris sont injectées avec des cellules cancéreuses et leurs poumons métastatiques sont combinés pour obtenir des cellules suppressives suffisante. Incuber les suspensions de cellule unique avec un anticorps anti-souris CD16/CD32 pendant 30 minutes sur la glace et tacher avec des anticorps fluorescents CD45, F4/80, CD11b, Ly6C et Ly6G (se reporter à la Table des matières) pour un autre 30 min10,11 , 13. Laver les cellules colorées une fois avec 1 mL de PBS contenant 2 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) et remettre en suspension le culot cellulaire avec 500-1000 μl de PBS contenant 2 % (p/v) BSA. Ajouter 3 μM de DAPI et M-MDSCs de tri (CD45 DAPI–+F4/80+Ly6G–CD11bhauteLy6Chaute) et SMMA (CD45 DAPI–+F4/80+Ly6G–CD11bhaute Ly6Cfaible) à l’aide d’un trieur de cellules (supplémentaire Figure 1).Remarque : Le seuil du niveau Ly6C de distinguer SMMA (Ly6Cbas) et M-MDSCs (Ly6Chaute) est basé sur celle des macrophages alvéolaires résidents (CCMR). La pureté des cellules triées est mesurée par cytométrie en flux, avec une pureté attendue de plus de 90 %. Remettre en suspension les cellules triées avec 400 μl de DMEM contenant 20 % (v/v) de SVF, 1 % (v/v) pénicilline/streptomycine, 2 mM de L-glutamine, acide aminé de 1 % (v/v) non essentiels, de pyruvate de sodium 1 mM et 50 nM 2-mercaptoéthanol (appelé enrichi-DMEM, E-DMEM). Compter le nombre de cellules vivantes à l’aide de la méthode exclusion bleu Trypan16 et régler à 2 x 106 cellules/mL avec E-DMEM. Garder les cellules sur la glace jusqu’à l’utilisation. 3. isolement des CD8+ T les cellules de la rate des souris Isoler la rate de souris qui est syngénique à la lignée de cellules cancéreuses de cible (c’est-à-dire, les souris C57BL/6 dans le présent protocole) comme suit : Euthanasier l’animal par l’inhalation de CO2 . Placez l’animal sur une planche de dissection propre et essuyer la peau avec l’éthanol à 70 % (v/v). Couper la peau abdominale à l’aide de ciseaux pour exposer la rate Isoler la rate, qui se trouve inférieur à l’estomac, et le placer dans un tube contenant 5 mL de PBS glacée. En utilisant le piston interne d’une seringue stérile de 5 mL, broyer la rate sur un tamis de cellule 100 μm sur un tube de 50 mL. Traverser les cellules du filtre à l’aide de total 10 mL de PBS. Centrifuger la suspension cellulaire à 337 x g pendant 5 min et aspirer le surnageant. Resuspendre le culot dans 1 mL de PBS contenant 2 mM EDTA et BSA de 0,5 % (p/v) (en cours d’exécution tampon) et filtrer à travers un tamis de cellule 40 μm. Compter le nombre de cellules vivantes et ajuster à 1 x 108 cellules/mL à l’aide de la mémoire tampon en cours d’exécution.Remarque : Conservez une petite aliquote de cellules sous forme d’échantillon pré-enrichissement pour une vérification de la pureté. Enrichir pour CD8+ T des cellules à l’aide d’une trousse de sélection négative et un trieur magnétique (voir Table des matières). Transférer 1 x 108 (1 mL) des splénocytes cellules dans un tube à fond rond 5 mL en polystyrène. Ajouter 50 μL d’anticorps biotinylé et incuber à température ambiante pendant 10 min. Ajouter 125 μL de streptavidine conjuguée des billes magnétiques et incuber à température ambiante pendant 5 min. Ajouter 1,325 mL de tampon et mélanger doucement en pipettant également. Placer le tube dans l’aimant et incuber à température ambiante pendant 2,5 min. Prenez l’aimant et versez la suspension cellulaire enrichie dans un nouveau tube. Remettre en suspension les cellules enrichis avec 200 μL de E-DMEM (i.e., DMEM contenant 20 % (v/v) de SVF, 1 % (v/v) de pénicilline/streptomycine, 2 mM de L-glutamine, acide aminé de 1 % (v/v) non essentiels, pyruvate de sodium 1 mM et 50 nM 2-mercaptoéthanol). Compter le nombre de cellules vivantes et régler à 2 x 106 cellules/mL avec E-DMEM. Garder les cellules à 37 ° C dans un CO2 incubateur jusqu’à utilisation.Remarque : Conservez une petite aliquote de cellules sous forme d’échantillon enrichissement consécutif pour une vérification de la pureté. Déterminer la pureté du CD8+ T cellules par cytométrie en flux, comme suit : Prendre 1 x 104 cellules de pré-enrichissement (étape 3.6) ou des échantillons après enrichissement (étape 3,9) et ajuster le volume total de chacun de 100 μL à l’aide de la mémoire tampon en cours d’exécution. Incuber les suspensions de cellule unique avec un anticorps anti-souris CD16/CD32 pendant 30 minutes sur la glace et tacher avec des anticorps fluorescents CD45, CD3, CD4 et CD8 (voir Table des matières) pour un autre 30 min. Laver les cellules colorées avec 500 μl de PBS contenant 2 % (p/v), BSA et remettre en suspension le culot cellulaire avec 500-1000 μl de PBS contenant 2 % (p/v) BSA. Ajouter 3 μM de DAPI et détermine le pourcentage du CD3+CD4–CD8 des cellules dans le CD45 total+ + population de cellules. 4. activation et l’expansion de l’isolé CD8+ T des cellules Aliquote 1 x 105 cellules par 50 μL CD8+ T cellules (préparés à l’étape 3.9) dans des puits d’une plaque de fond U 96 puits. Ajouter 1 x 105 cellules / 50 μL suppresseur cellules (préparés à l’étape 2.7) ou 50 μL de E-DMEM dans les puits. Préparer le moyen d’activation qui se compose de E-DMEM, facteur stimulant les colonies de U/mL 4 x 104 1 (CSF-1), interleukin-2 de 240 U/mL (il-2), 8 μg/mL de CD3ε anticorps anti-souris et 16 μg/mL d’anticorps CD28 anti-souris.NOTE : CSF-1 n’est pas requise pour l’activation des lymphocytes T, mais il est essentiel pour la survie des cellules suppressives dans le présent protocole (SMMA et M-MDSCs). Ainsi, il est maintenu dans la co-culture de cellules T avec cibler les cellules cancéreuses pour maintenir la cohérence dans les conditions de culture. Étant donné que le CSF-1 se trouve dans des concentrations de nano-molaire dans tous les tissus et est requis pour la viabilité de monocytes/macrophages in vivo, il s’agit d’un contexte physiologique pour ces cellules. Ajouter 50 μL de support d’activation (étape 4.3) et 50 μL de E-DMEM avec ou sans réactifs à tester. Placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C, humidité de 95 % et 5 % de CO2 et de la culture des cellules pendant 4 jours. 5. installation de co-culture de cible cellules CD8 pré-activé+ T des cellules Ajouter 30 μL de matrice de dilué le facteur de croissance-réduit soluble membrane basale au 1/100 (Table des matières) dans les puits d’une plaque 96 puits fond plat pour la microscopie et incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO2 pendant au moins 1 h. Préparer les cellules cibles (c.-à-d., les cellules E0771-LG exprimant la protéine fluorescente rouge nucléaire restreints). Incuber les cellules cibles avec 1 mL de 0.05 % trypsine/EDTA à température ambiante pendant 1 min et récolter les cellules en pipettant également, doux. Ajouter 9 mL de DMEM dont 10 % (v/v) de SVF et centrifuger la suspension cellulaire à 337 x g pendant 5 min. Remettre en suspension les cellules avec 500 μL d’E-DMEM et compter le nombre de cellules vivantes.Remarque : Avant de compter les cellules cibles, filtrer les cellules à travers un tamis de cellules 40μm pour produire la suspension cellulaire unique. Ajuster la densité à 2 x 104 cellules/mL (= 1 x 103 cellules / 50 μL) en ajoutant des E-DMEM et garder les cellules sur la glace. Préparer les cellules effectrices (c.-à-d. pré-activé CD8+ T des cellules). Remettre les cellules dans un puits de la plaque à 96 puits (étape 4.5) soigneusement par pipetage et transfert le CD8 flottant+ T cells dans un nouveau tube de 1,5 mL.NOTE : SMMA et M-MDSCs fermement adhèrent au puits et ne sont pas détachés par le pipetage. Pour recueillir les cellules restantes, ajouter 200 μl de PBS dans le puits et transférer dans le tube à l’étape 5.3.1. Laver les cellules avec 1 mL de E-DMEM une fois (centrifugeuse à 337 x g) pendant 5 min, aspirer et jeter le surnageant) et les remettre en suspension avec 100 μL de DMEM-E. Compter le nombre de cellules vivantes (à l’aide de la méthode d’exclusion du bleu trypan), ajuster la densité de 1,6 x 105 cellules/mL (= 4 x 103 cellules/25 μL) et garder les cellules sur la glace. Aspirer la matrice de la membrane basale de chaque puits de la plaque à l’étape 5.1. Ajoutez 1 x 103 cellules/50 μL des cellules cibles (étape 5.2.4) dans chaque puits et mélangez bien.Remarque : Pour éviter les effets de bord due à l’évaporation du médium, seulement les puits intérieurs 60 des 96 bien plaque devrait servir pour l’analyse. Ajouter 25 μL de E-DMEM dont 4 x 103 IL-2 U/mL et un substrat fluorogène caspase-3 10 μM (voir Table des matières). Ajouter 4 x 103 cellules/25 μL de CD8+ T dans les cellules (étape 5.3.4) approprié puits et mélangez bien.Remarque : La présence de trop de cellules dans un endroit bien complique l’analyse. Dans ce modèle, un effecteur de 4:1 : ratio cible (total cellule numéro 5 x 103 cellules/puits) était optimale, mais un ratio 8:1 était pas optimal. Puits contenant les quatre commandes suivantes sont nécessaires afin de faciliter l’analyse des données : cibler les cellules à la densité utilisée pour les puits de culture mixte (1 x 103 cellules/puits) dans le milieu avec et sans substrat de caspase-3, les cellules effectrices (1 x 103 cellules / bien) dans un milieu avec et sans substrat de caspase-3. Ajouter 200 μL d’eau stérile ou de PBS dans tous les puits vides (en particulier les puits sur la périphérie de la plaque) pour réduire l’évaporation du milieu de puits expérimentaux. Mettre la plaque dans un microscope à fluorescence time-lapse qui est maintenu à 37 ° C, humidité de 95 % et 5 % de CO2.NOTE : Secouer la plaque en forme de croix à répartir toutes les cellules et puis laissez la plaque de rester à la température ambiante sur une surface plane pendant 10-20 min avant de les transférer dans l’incubateur. 6. l’imagerie des cellules NOTE : Les paramètres d’acquisition image détaillée peut varier avec le microscope et les fluorophores utilisés ; les paramètres d’acquisition générales suivantes devraient être utilisées pour des résultats optimaux. À l’aide d’une routine de mise au point automatique approprié sur le microscope, acquérir des images couvrant au moins 25 % de la surface totale dans chaque puits expérimental de la plaque à 96 puits. Régler le microscope pour acquérir des images à contraste de phase, mais aussi un canal fluorescent approprié pour la protéine fluorescente rouge nucléaire restreints (mKate2) et un canal fluorescent approprié pour le vert fluorogène activé substrat de caspase-3 (avec excitation à 488 nm) (Figure 2). Capturer des images dans les puits expérimentales en contraste de phase et les 2 canaux fluorescents toutes les 1 à 3 h pendant au moins 72 h. 7. image analysis, en utilisant le logiciel d’analyse image NOTE : Les paramètres d’analyse image détaillée changeront avec le logiciel utilisé (voir la Table des matières) ; les procédures d’analyse générales suivantes devraient être utilisées pour des résultats optimaux. Déterminer si spectrale non mélange est nécessaire pour séparer le signal fluorescent émis par les noyaux des cellules de cible qui émis par les noyaux apoptotic et si nécessaire, mettre en place un protocole d’analyse pour y parvenir ; Afficher un contrôle bien contenant uniquement les cellules cibles (mkate2-étiqueté) dans un milieu sans substrat de caspase-3 dans le canal vert fluorescent. Observer si une fluorescence verte est émise par les noyaux rouges (noyaux apparaissent vertes) Si la fluorescence verte est apparente dans les noyaux, accéder au contrôle de déconvolution spectral dans le logiciel d’imagerie et augmenter le pourcentage de rouge enlevé du vert jusqu’à ce que disparaisse le signal vert (d’après notre expérience, il s’agit généralement 6-7 % pour mKate2 brillant fluorescence). Si la fluorescence verte n’est pas apparente dans les noyaux, aucune déconvolution spectrale n’est nécessaire.Remarque : Ce test de correction déconvolution spectrale peut aussi effectué à l’aide d’un puits de cibler les cellules dans un milieu contenant le substrat de la caspase-3. Cependant, il y a généralement un niveau très bas d’apoptose spontanée dans les cellules cibles (moins de 10 %), ce qui entraîne quelques noyaux de cellules cibles émettant une fluorescence verte en raison de l’activation de la caspase-3 et non fluorescence saigner à travers. Purge de fluorescence vrai à travers est évident dans ces conditions alors fluorescence verte est manifeste dans tous les noyaux. Consulter un contrôle cupule contenant les cellules effectrices seul (noyaux non) dans un milieu sans substrat de caspase-3 dans le canal rouge et vert individuellement. Observer si une fluorescence verte ou rouge émise par les noyaux. Si ni rouge ni vert fluorescence est apparente dans les canaux individuels aucune déconvolution spectrale n’est nécessaire.Remarque : dans notre expérience, la souris CD8+ T les cellules ne sont pas auto-fluorescentes et donc aucune déconvolution spectrale n’est nécessaire pour ces cellules. Cet essai de correction déconvolution spectrale peut également effectuer à l’aide d’un puits de cellules effectrices dans un milieu contenant le substrat de la caspase-3. Cependant, il y a habituellement un niveau d’apoptose spontanée résultant dans les noyaux des cellules effectrices émettant une fluorescence verte due à l’activation de la caspase-3. Purge de fluorescence vrai à travers est évident dans ces conditions alors fluorescence verte est manifeste dans tous les noyaux. Utilisez une méthode de soustraction de fond de fluorescence (p. ex., TopHat), avec des paramètres pertinents pour l’exemple, pour résoudre les objets fluorescents dans les deux canaux fluorescent.Remarque : Dans le canal vert, nous avons utilisé TopHat (rayon de noyaux = seuil de fluorescence 10,0 µm, vert = 0,7 vert calibration unités). Dans le canal rouge, nous avons utilisé TopHat (rayon de noyaux = seuil de fluorescence 10,0 µm, rouge = 0,5 unités de calibrage rouge). Utiliser les paramètres appropriés pour le fractionnement du bord pour résoudre les différents noyaux fluorescents.NOTE : Nous n’avons pas utilisé bord fractionnement dans le chenal de fluorescence verte ou rouge. Utiliser des images dans le canal rouge provenant des puits contenant uniquement des cellules cibles (avec substrat de caspase) pour déterminer la taille minimale des noyaux cibles.NOTE : Nous avons utilisé 80 µm2. Utiliser des images dans le canal vert provenant des puits contenant uniquement les cellules effectrices (avec substrat de caspase) pour déterminer la taille moyenne des noyaux effectrice apoptotic.Remarque : Single noyaux d’effectrice apoptotic varies entre 40 – 80 µm2 dans ces expériences. Mettre en place une procédure d’analyse pour compter le nombre de noyaux de cellules fluorescentes cible à l’aide d’une restriction de taille minimale appropriée (par exemple, la superficie minimale, diamètre minimal) (Figure 2, masque de détection de cible).NOTE : Nous avons utilisé une superficie minimale de noyaux (fluorescence rouge) = 80 µm2. Mettre en place une procédure d’analyse pour compter le nombre de noyaux apoptotic qui sont plus grandes que la taille moyenne des noyaux de processeur d’effets apoptotiques (Figure 2, masque de taille restreinte de l’apoptose).Remarque : Filtre de taille a été défini à 80 µm2 (c’est-à-dire que les zones de plus grand que cette taille de fluorescence verte ont été dénombrés, excluant ainsi les noyaux d’effectrice apoptotic unique ). À l’aide de ces paramètres augmente l’exactitude de l’analyse en comptant les noyaux des cellules apoptotic cible mais certains agrégats de cellules effectrices apoptotic peuvent être comptés. Mettre en place une procédure d’analyse pour compter le nombre de cellules en apoptose cible en comptant les noyaux où un signal fluorescent rouge (de l’étape 7,6) et signal fluorescent vert taille restreinte (de l’étape 7,7) significativement co localiser (Figure 2, R Masque de chevauchement/g).Remarque : Une co-localisation appropriée peut varier de 30 % à 100 % de la taille moyenne des noyaux cibles. Filtre de taille de chevauchement a été défini à 40 µm2. Déterminer le nombre de noyaux de cellules apoptotiques cible ainsi que le nombre de noyaux de cellules de cible dans les puits pour chaque condition expérimentale au cours de toute période. 8. analyse à l’aide de calcul et la représentation graphique des logiciels Le graphique du nombre de noyaux de cellules apoptotiques cible obtenu à l’étape 7,9 au cours de toute période pour les puits expérimentales. Si plusieurs puits ont été utilisés pour chaque condition expérimentale, graphiquement présentent les résultats en moyenne ± écart-type. Calculer la fraction apoptotique de la population de cellules cibles en divisant le nombre de cellules apoptotiques dans chaque puits par le nombre de cellules cibles dans chaque puits à chaque instant. Graphique des résultats obtenus à l’étape 8.2. Déterminer l’aire sous la courbe (AUC) pour chaque courbe. La fraction d’apoptotic de pic de la population pour chaque courbe peut également déterminer ainsi que le moment auquel le pic se produit, si vous le souhaitez. Déterminer si l’AUC déterminée pour les conditions expérimentales sont significativement différentes à l’aide de tests statistiques appropriés.Remarque : Le test t non apparié avec correction de Welch a été appliqué au résultat AUC.

Representative Results

Cette méthode est basée sur une co-culture simple de cibler les cellules cancéreuses avec effectrices CD8+ T des cellules qui ont été préalablement cultivées avec ou sans cellules suppressives en présence d’anticorps activation anti-CD3/CD28. Il détecte CD8+ cancer des lymphocytes T-induit l’apoptose des cellules au fil du temps suivant la co-culture, permettant ainsi l’évaluation des effets des cellules suppressives sur la cytotoxicité des CD8+ T des cellules. Les cellules cancéreuses augmentent généralement, fluorescence vert dans leurs noyaux après l’activation d’un biocapteur de caspase ciblage nucléaire lorsque ces cellules entrer en contact avec CD8+ T des cellules qui sont préactivées par les anticorps en l’absence de suppresseur cellules ( Figure 3; Film supplémentaire 1). Une fluorescence verte du substrat de caspase était détectable pendant au moins 15 h après que l’apoptose a été lancé. Certains apoptose spontanée d’effecteur CD8+ T cellules a également été observée au fil du temps même si ces cellules sont cultivées isolément (Figure 4; Film supplémentaire 2). Cependant, les tailles de noyaux de CD8+ T cellules sont plus petites que celles des cellules cancéreuses et ainsi les cellules apoptotiques « effecteur » peuvent être exclues de l’apoptose des lymphocytes « cible » par une méthode d’analyse taille restriction image (Figure 2 et Figure 4). Bien que certains cibler les cellules cancéreuses montrent une petite forme arrondie sans fluorescence verte, cela n’affecte pas l’analyse que ces cellules subissent une mitose plutôt que l’apoptose (complémentaire Movie 3) et sont ainsi exclus apoptotiques « cible » les numérations par un masque rouge/vert chevauchement (complémentaire Figure 2). Apoptose spontanée de cibler les cellules cancéreuses se trouve parfois même dans la culture unique (3 de film supplémentaire). Toutefois, la co-culture de cancer cible cellules CD8 pré-activé+ T cellules à l’apoptose des cellules tumorales accrue au-dessus des niveaux d’apoptose spontanée en monoculture des cellules cancéreuses (Figure 4). En règle générale, lorsque vous utilisez un rapport optimal de cibler les cellules cancéreuses pour les cellules effectrices, un pic du nombre d’apoptotic cibler les cellules cancéreuses peut être observé (Figure 5 a). Ce pic est plus nette lorsque les données sont exprimées comme la fraction apoptotique de la population de cellules de cible (Figure 5 b). Dans cette expérience l’apoptose basale des cellules tumorales cible a culminé à 24h (avec fraction apoptotique = 0,08), mais CD8+ l’apoptose induite par des lymphocytes T atteint un niveau maximum à 17 h (avec fraction apoptotique = 0.66). De plus, nous avons constaté que CD8+ T cellules préalablement incubées avec le SMMA ou M-MDSCs pourraient faire entrer en contact avec cibler les cellules cancéreuses, mais ce contact semblait résulter dans des cas moins de l’apoptose des cellules du cancer par rapport aux CD8+ T cellules pré-activé sans cellules suppressives (Figure 3 et Figure 4; Film supplémentaire 4 et film supplémentaire 5). Bien que le CD8+ T cellules préalablement incubées avec les cellules myéloïdes parfois induit l’apoptose des cellules du cancer, il y avait également une prolifération de cibler les cellules cancéreuses qui n’ont pas été stimulé à l’apoptose au cours de l’évolution temporelle de la expérience (6 de film supplémentaire). Conformément à ces conclusions, la fraction de la crête des cellules cancéreuses apoptotic cultivées avec CD8+ T cellules préalablement incubées avec cellules myéloïdes (fraction apoptotique = 0,38 à 23 h pour MDSC-E et 0,25 à 20 h pour MAM-E) était significativement plus faible que celle des cellules cancéreuses cultivées avec CD8+ T cells qui n’étaient pas préalablement incubées avec les cellules suppressives (Figure 6). Figure 1 : un schéma montrant la procédure expérimentale. Naïve splénique CD8+ T les cellules sont cultivées avec des anticorps d’anti-CD3/CD28 activation, avec ou sans métastases associées aux macrophages (SMMA) ou suppresseur monocytaire myéloïde-dérivées de cellules (M-MDSCs). Après 4 jours, flottant CD8+ T les cellules sont recueillies et cultivées conjointement avec cibler les cellules cancéreuses en présence d’un substrat fluorogène caspase-3. Cellules cancéreuses apoptotiques sont détectés sous fluoroscopie en temps réel. Les images ont été acquises à l’aide d’une plate-forme d’imagerie cellulaire direct (voir Table des matières). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Identification des cellules en apoptose cible distinctes de cellules effectrices apoptotic. Acquisition d’Image : rangée du haut dans le canal rouge permet l’identification des noyaux de cellules cibles par masque de détection de cible (masque d’analyse rose). Rangée du milieu : les Images acquises dans le canal vert indiquent apoptotique des cellules effectrices et cible. Asize restreint l’apoptose masque (masque analyse teal ; supérieur à 80 µm2) permet seul apoptotique des cellules effectrices à exclure de l’analyse. Rangée du bas : composite images fusionnée rouge et verts canaux avec image de contraste phase (à gauche) ou rouge/vert chevauchent masque (à droite). Identification de fluorescence verte co localisé, de taille restreinte avec fluorescence rouge (masque d’analyse jaune), permet une détection plus précise des apoptotic noyaux cibles (flèche jaune) en excluant les agrégats de cellules effectrices en apoptose (blanc pointes de flèche). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Interaction entre CD8+ T les cellules et les cellules cancéreuses. Photos du représentant time-lapse films des cellules cibles E0771-LG_NLR (T) cultivées conjointement avec effectrices CD8+ T (E) des cellules au ratio 4:1 effecteur/cible. MDSC-E et MAM-E indiquent les cellules effectrices préalablement incubées avec M-MDSCs et SMMA respectivement. Image composite (y compris les images de chaînes de phase contrast, rouge et vert) sont affichées. Pointes de flèche sont suivi les mêmes cellules à travers les différents domaines et les points dans le temps. Jaune de pointes de flèches : une cible qui associe des effecteurs et subit des pointes de flèches de l’apoptose, blanc : une cible qui associe des effecteurs, mais ne subit pas l’apoptose. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : détection de cellules cancéreuses apoptotic. Champs représentant extraites de films de time-lapse à 18 h après l’imagerie. Des images composites (left ; canaux de phase contrast, rouge et vert) et du rouge canal sans (au milieu) ou avec chevauchement (à droite) rouge/vert masque (jaune) sont affichés. Points jaunes dans la colonne de droite représentent les cellules cancéreuses apoptotic. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 5 : CD8+ cancer des lymphocytes T-induit l’apoptose des cellules. (A) nombre d’apoptotic cellules cancéreuses cultivées avec effecteur C8+ T cellules à différents effecteurs au ratio cible (E:T). (B) Apoptotic fraction de la population de cellules cibles. Les données sont moyen ± SD. moyenne surface sous la courbe (AUC) est également indiqué. Non appariés t-test avec correction de Welch a été utilisé pour analyser les AUC. * P < 0,0001 comparé à E:T = 0:1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 6 : Effets des cellules myéloïdes-infiltration tumorale sur la cytotoxicité des CD8+ T des cellules. (A) nombre de cellules cancéreuses apoptotiques (cible : T) cultivé avec C8+ T cellules (effecteur : E) 4:1 de rapport de E:T. CD8+ T a pré cultivé des cellules en l’absence (cercle noir) ou la présence de cellules suppressives monocytaire myéloïde-dérivé (MDSC-E: blue circle) ou métastases associées aux macrophages (MAM-e : cercle rouge). Données sont moyen ± SD. (B) Apoptotic fraction de la population de cellules cibles. Les données sont moyen ± SD. signifie AUC est aussi indiquée. Non appariés t-test avec correction de Welch a été utilisé pour analyser les AUC. * P < 0,0001 par rapport à T, #P < 0,0001 comparé à E + T. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Supplémentaire Figure 1. Stratégie de blocage pour isoler les cellules suppressives du poumon métastatique. (A) point représentatif complote pour isoler les cellules monocytaire suppresseur d’origine myéloïde (M-MDSCs) et les macrophages associées aux métastases (SMMA). Le seuil de niveau de Ly6C pour distinguer la SMMA (Ly6Cbas) et M-MDSCs (Ly6Chaute) est basé sur celle des macrophages alvéolaires résidents (CCMR). Pureté (B) des M-MDSCs triés (CD45+Ly6G–CD11b +Ly6Chaute) et SMMA (CD45+Ly6G–CD11b +Ly6Cfaible). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier. Supplémentaires Figure 2. Images représentant des cellules cibles mitotique. Photos du représentant films time-lapse de mono-culture de cellules de cible E0771-LG_NLR. Haut : images composites, y compris les images de chaînes de phase contrast, rouge et vert. En bas : des images composites (canaux rouge et vert) avec masque rouge/vert chevauchement. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier. Supplémentaire Figure 3. Effets des cellules myéloïdes-infiltration tumorale sur la prolifération des CD8+ des cellules de T. (A) représentant histogrammes montrant la dilution de marquage fluorescent avec CFSE en CD8+ T des cellules. Naïve splénique CD8+ T les cellules ont été isolées comme décrit dans le protocole-3 et étiquetés avec 5 µM de CFSE à 37 ° C pendant 15 min. Les cellules T marquées ont été cultivées en présence de IL-2 et anti-CD3/CD28, activation des anticorps avec ou sans cellules myéloïdes comme décrit dans le protocole N° 4. Après 4 jours, une fluorescence verte dans les cellules T a été détectée par cytomètre en flux. (B) indice de Division de CD8+ T cellules calculé comme décrit précédemment17. Les données sont des moyens ± SEM. * P < 0,01 par rapport à contrôler, #P < 0,05 par rapport à αCD3/CD28 AB. s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier. Film supplémentaire 1. Film de Figures 3 et 4 ; E + T. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier. Film supplémentaire 2. Film de Figures 3 et 4 ; Effecteur (E). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier. Film supplémentaire 3. Film de Figures 3 et 4 ; Cible (T). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier. Film supplémentaire 4. Film de Figures 3 et 4 ; MDSC-E + T. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier. Film supplémentaire 5. Film de Figures 3 et 4 ; MAM-E + T. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier. Film supplémentaire 6. Film de Figures 3 et 4 ; MAM-E + T (prolifération). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Cette méthode repose sur deux étapes distinctes de co-culture : co-culture CD8+ T de cellules avec des cellules suppressives potentiels, et co-culture le CD8 « pré-conditionnés »+ T cells avec cellules tumorales de cible (Figure 1). La première étape de co-culture est tout à fait similaire à celle des CD8+ T cell tests de prolifération habituellement utilisées pour déterminer l’effet des cellules suppressives sur CD8+ la fonction des cellules T. Toutefois, la prolifération des cellules T n’est pas toujours corrélée avec leur cytotoxicité. Par exemple, nous avons trouvé cette culture mixte avec M-MDSCs ou SMMA a augmenté plutôt que réduit la prolifération des CD8+ T cellules en présence de CD3/CD28, activation des anticorps (supplémentaire Figure 3), tandis que ceux-ci pré-conditionnés CD8+ T cells a démontré réduit cytotoxicité contre les cellules cancéreuses de cible (Figure 4, Figure 5, Figure 6). Ces résultats soulignent l’importance de l’évaluation de l’activité fonctionnelle, témoigne de l’apoptose cellulaire du cancer cible, offert par cette CD8+ test de cytotoxicité des lymphocytes T.

Dans ce test, nous avons identifié que CD8+ T des cellules nécessite environ 15 h de culture mixte afin d’induire l’apoptose maximale des cellules de tumeurs mammaires de souris E0771-LG (Figure 5). Ce retard pourrait s’expliquer par le décalage entre le premier contact des cellules effectrices avec cibles et accompagnent la formation des synapses immunitaire, ainsi que temps nécessaire pour induire des signaux apoptotic dans des cibles tel que mesuré par l’activation de la caspase-3 (supplémentaire Movie 1 ). Nous avons également identifié que le nombre de cellules tumorales apoptotiques atteint un plateau après 24 h, ce qui est probablement dû à l’élimination des cibles par les cellules T et/ou une perte de signal fluorescent des cellules mortes. Cette capacité à identifier l’heure de pointe l’apoptose est un avantage majeur de ce test car la détermination d’un point temporel optimal est importante pour des comparaisons appropriées entre les différentes conditions. Dans notre cas, par exemple, la différence de cytotoxicité entre contrôle CD8+ T cellules et CD8 MDSC/MAM-instruits+ T cellules était beaucoup plus grande à 15-18 h par rapport à 72 h (Figure 5), et donc un point de terminaison expérimenter en utilisant une période d’incubation de 72 h produirait des résultats trompeurs.

Cette méthode permet aussi la visualisation de l’interaction en temps réel de cellules effectrices à l’objectif, qui fournirait les mieux informés sur le mécanisme sous-jacent de cytotoxicité limitée de CD8+ T cellules préalablement incubées avec cellules suppressives. Par exemple, nous avons constaté que CD8+ T cellules préalablement incubées avec M-MDSCs ou SMMA rencontrées et interagissent avec les cellules de tumeur de cibles mais n’a pas toujours induit l’apoptose (supplémentaire film 4 et 5 de film supplémentaire, supplémentaires film 6). Bien que nous n’ont pas quantifié cet événement, il serait faisable et intéressant de quantifier et de comparer la proportion de rencontres et de leur temps d’interaction en corrélation avec l’induction de l’apoptose. Un autre avantage majeur est que cette méthode nécessite un petit nombre de cellules (par exemple, 1 x 103 de la cible) et 4 x 103 des cellules effectrices par puits. En fait, ce protocole peut être davantage miniaturisé pour le format de plaque 384 puits si vous le souhaitez. Par conséquent, ce dosage est approprié pour les expériences et le criblage à haut débit où le nombre de cellules est limité telles que in vitro tests utilisant des cellules précieux dérivé d’in vivo ou ex vivo des échantillons.

En revanche, une limitation du test actuel est la présence d’un nombre important de cellules effectrices morts dans certaines conditions. Afin d’augmenter la précision en distinguant l’apoptose des cellules cancéreuses cible de celle des effecteurs CD8+ T cells, les noyaux de cellules sont étiquetés de cible et une restriction de taille (ce qui exclut les cellules effectrices) est appliquée pour l’analyse des données dans le présent des noyaux dosage (Figure 2). Cependant, il y a certains cas où les cellules de recouvrement au moyen d’agrégats d’apoptose (vert) CD8+ T sur non-apoptotique cibler les cellules cancéreuses, qui peuvent entraîner des résultats. Cette limitation pourrait être atténuée par l’utilisation d’une colonne de suppression des cellules mortes sur avant les cellules effectrices co-culture avec des cellules tumorales cible, en supposant qu’un nombre suffisant de cellules effectrices est disponible. Avec des systèmes plus complexes de microscopie, il est également possible de réduire le signal positif faux en les marquant l’effecteur CD8+ T les cellules avec un fluorophore distingue les noyaux de cellules de cible et de la caspase-3 un substrat fluorogène.

Jusqu’ici, ce protocole a été utilisé pour étudier l’activation de non spécifiques de l’antigène de CD8+ T des cellules. Bien que MDSCs et TAMs dans le microenvironnement tumoral suppriment les fonctions des lymphocytes T par l’intermédiaire de mécanismes non spécifiques de l’antigène, MDSCs dans les tissus lymphoïdes périphériques suppriment les lymphocytes T à un antigène spécifique de manière18. Pour étudier les fonctions suppresseurs immunitaires de ces types de cellules, un test de prolifération in vitro à l’aide de CD8+ T cells d’OT-1 souris transgéniques est couramment utilisé. Dans ce test, les cellules d’OT-1 T (exprimant le récepteur de cellules T spécifiques de l’ovalbumine (OVA)) sont conjointement cultivées avec suppresseur MDSCs en présence de peptides d’ovules, qui s’applique pour la première culture dans notre test de cytotoxicité (i.e., activation de T cells dans la présence ou l’absence de suppresseurs). Il est également possible de manipuler de cibler les cellules cancéreuses pour exprimer les ovules, ce qui peuvent induire la mort cellulaire du cancer spécifique de l’antigène par les cellules OT-1 T. Donc, le dosage permettra également aux enquêtes de la MAM/MDSC-mediated suppression d’activation des cellules T spécifiques de l’antigène. Il est également possible d’appliquer le test afin d’enquêter sur des cellules humaines, comme l’activation anticorps contre humain CD3 et CD28 sont disponibles dans le commerce, et un protocole d’isoler TAMs humaines provenant d’échantillons cliniques a été établi19.

Collectivement, ce dosage est très polyvalent et peut être utilisé pour examiner la cytotoxicité des autres types de cellules immunitaires. Actuellement, dans nos laboratoires, il est étendu afin d’examiner la cytotoxicité cellulaire dépendante de l’antigène dans diverses conditions et est également en cours d’élaboration pour un débit élevé de dépistage.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation Wellcome Trust (101067/Z/13/Z (GTM), 109657/Z/15/Z (TK), 615KIT/J22738 (TK), UK) et le MRC (MR/N022556/1 (GTM, TK), UK). CNP et DDS souligner le soutien de l’Initiative nationale de phénotypique Screening Centre Phenomics découverte et Cancer Research UK (CNP)

Materials

0.05% Trypsin EDTA (1X) Gibco 25300-054
12-Well Cell Culture Plate Freiner Bio-One 665-180
1x PBS Gibco 14190-094
2-mercaptethanol Sigma M6250-10ML
5mL Plystyrene Round-Bottom Tube FALCON 352054
96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom ) Costar 3799 Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells
96-well plate (Flat bottom) Nunc 165305 Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay
AF647 anti-mouse F4/80 Antibody BIO-RAD MCA497A647 Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 μL/1×10^6 cells
AlexaFluor700 anti-mouse CD8 Antibody Biolegend 100730 Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 μL/1×10^6 cells
anti-mouse CD28 Antibody Biolegend 102111 Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340
anti-mouse CD3e Antibody Biolegend 100314 Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720
APC anti-mouse CD3 Antibody Biolegend 100236 Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 μL/1×10^6 cells
APC/Cy7 anti-mouse Ly6C Antibody Biolegend 128026 Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 μL/1×10^6 cells
Bovine Serum Albmin Sigma A1470-100G
Cell Strainer (100μm Nylon) FALCON 352360 To smash the spleen
Cell Strainer (40μm Nylon) FALCON 352340 To filter the lung digestion
DAPI Biolegend 422801
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium Gibco 41966-029
EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit StemCell Technologies 19853
Fetal Bovine Serum Gibco 10270-106
FITC anti-mouse CD4 Antibody Biolegend 100406 Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 μL/1×10^6 cells
Geltrex Ready-to-Use Gibco A1596-01 Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay
IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagent Essen BioScience 4476 Lenti viral particules encoding mKate2
IncuCyte ZOOM Essen BioScience Detector (fluorescence microscope)
IncuCyte ZOOM 2018A Essen BioScience Analysis software
L-Glutamine (100X) Gibco A2916801
Lung Dissociation Kit Miltenyi 130-095-927 Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit Lonza LT07-318
Non-essential amino acid (100X) Gibco 11140-035
NucView488 Biotium 10403 Fluoregenic caspase-3 substrate
PE anti-mouse Ly6G Antibody Biolegend 127607 Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 μL/1×10^6 cells
PE/Cy7 anti-mouse CD11b Antibody Biolegend 101216 Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 μL/1×10^6 cells
Pen Strep Gibco 15140-122 Penicillin Streptomycin for primary culture of cells
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Antibody Biolegend 103132 Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 μL/1×10^6 cells
Polybrene (Hexadimethrine bromide) Sigma H9268
Puromycin Gibco A11138-03
RBC Lysis Buffer (10X) Biolegend 420301
Recombinant murine IL-2 Peprotech 212-12 Activation of isolated CD8+ T cells
Sodium pyruvate (100X) Gibco 11360-070
TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Antibody Biolegend 101320
 : Nikon 10X objective (resolution 1.22 µm)
 : Green channel excitation: 440 – 480 nm
 : Green channel emission: 504 – 544 nm
 : Red channel excitation: 565-605 nm
 : Red channel emission: 625 – 705 nm
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Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Kitamura, T., Doughty-Shenton, D., Pollard, J. W., Carragher, N. O. Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells. J. Vis. Exp. (143), e58841, doi:10.3791/58841 (2019).
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