마우스와 차세대 시퀀싱에 의해 인간의 항 체 레파토리의 식별
1Graduate School of Life and Environmental Sciences,University of Tsukuba, 2Center for Influenza Virus Research,National Institute of Infectious Diseases, 3School of Science and Technology,Kwansei Gakuin University, 4Department of Pathology,National Institute of Infectious Diseases, 5Division of Infectious Diseases Pathology, Department of Global Infectious Diseases,Tohoku University Graduate School of Medicine, 6Division of Molecular Pathobiology, Research Center for Zoonosis Control,Hokkaido University, 7Division of Collaboration and Education, Research Center for Zoonosis Control,Hokkaido University, 8Global Station for Zoonosis Control, GI-CoRE,Hokkaido University, 9Department of Immunology,National Institute of Infectious Diseases, 10Faculty of Life and Environmental Sciences,University of Tsukuba
Summary
여기, 우리는 프로토콜 분석 및 구조 시각화 및 전체 항 체 레파토리의 헌법에 대 한 설명. 이 다음-세대 시퀀싱을 사용 하 여 항 체 RNA의 광대 한 시퀀스의 수집을 포함 한다.
Abstract
항 체에 의해 항 원 인식의 엄청난 적응성 획득된 면역 체계의 기초 이다. 획득된 면역 시스템에 의해 항 체의 광대 한 레 퍼 토리의 생산을 기본 분자 메커니즘의 우리의 이해에도 불구 하 고 그것은 아직 되지 않았습니다 완전 한 항 체 레 퍼 토리의 전역 보기에서 도착 수 없습니다. 특히, B 셀 레파토리 항 체 클론의 그들의 천문학적인 수 블랙 박스도 간주 되었다 있다. 그러나, 차세대 시퀀싱 기술 B 셀 레 퍼 토리에 대 한 우리의 이해를 증가 하는 획기적인 사용 됩니다. 이 보고서에서 우리는 시각화 하 고 전체 개별 마우스 및 인간의 항 체 레파토리를 분석 하는 간단 하 고 효율적인 방법을 설명 합니다. 면역 기관에서 대표적으로 생쥐에서 비장 및 인간, 말 초 혈액 단 셀에서 총 RNA 되었고 준비, 문자, 5′-경주 메서드를 사용 하 여 증폭. 항 체 클래스 관련 일정 도메인에 대 한 보편적인 앞으로 뇌관 및 센스 뇌관을 사용 하 여, 항 체 mRNAs 항 체 인구에 있는 그들의 주파수를 반영 비율에 균일 하 게 증폭 했다. amplicons 차세대 시퀀싱 (NGS), 면역학 샘플 당 10 이상5 항 체 시퀀스를 생성 하 여 시퀀싱 했다. 우리 V (D) J 유전자 세그먼트 주석, 항 체 레 퍼 토리, 그리고 우리의 계산 방법의 조감도 포함 하 여 항 체 시퀀스 분석에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.
Introduction
항 체 시스템 획득된 면역 시스템의 기본 중 하나입니다. 그것은 그것의 광대 한 다양성, 벌금 항 원 인식 특이성 및 항 원 특정 B 세포의 클론 확장 병원 체 침입에 대 한 매우 강력한. 항 체 생성 B 세포의 레 퍼 토리 10 이상으로 추정 되는 단일 개별1에서15 . 이 거 대 한 다양성은 면역 글로불린 유전자 loci2VDJ 유전자 재조합의 도움으로 생성 됩니다. 전체 B 세포 레파토리와 항 원 면역 반응에 그들의 동적 변화 설명 이지만 도전, 따라서 침입 병원 체에 대하여 항 체 응답에 대 한 완전 한 이해에 필수적인.
그들의 천문학 다양성 때문에 B 세포 레파토리 블랙 박스;로 간주 하고있다 그러나, NGS 기술의 출현에 도달해 그들의 복잡성3,4의 향상 된 이해를 수 있게 되었습니다. 전체 항 체 레파토리가 되었습니다 성공적으로 분석, 첫째로 zebrafish5, 다음 쥐는6, 그리고 인간의6,7. NGS는 적합 한 면역 반응의 연구에 강력한 도구가 되고있다 지금, 비록 기본적인 분석의 공통점과 차이점 개별 동물 중에서 항 체 레파토리에는 부족 한.
쥐, 그것은 IgM 레파토리는 개인 사이, 거의 동일한 반면 IgG1 및 IgG2c는 개인8사이 실질적으로 다른 것으로 알려졌다. V-유전자 사용 프로필 외에도 순진한 주변 B 셀에 VDJ 프로 파일의 관찰 된 주파수가 비슷합니다 매우 개인8사이. VDJ 영역의 아미노산 시퀀스의 분석 또한 보였다 같은 접합 시퀀스의 발생 다른 쥐 생각8이전 보다 훨씬 더 자주. 이 결과 항 체 레 퍼 토리 형성 메커니즘 보다는 확률적 결정적5,,89수를 나타냅니다. 생쥐에서 항 체 레 퍼 토리 개발의 과정은 또한 되었습니다 성공적으로 분석 NGS를 사용 하 여 추가 세부10항 체 면역 시스템을 밝히기 위해서 NGS의 잠재력을 강조 하.
이 보고서에서 우리는 시각화 하 고 분석 하는 세계적인 수준의 항 체 레 퍼 토리는 간단 하 고 효율적인 방법을 설명 합니다.
Protocol
모든 동물 실험과 국립 연구소의 전염 성 질병 동물 관리 및 사용 위원회의 승인 기관 지침에 따라 수행 했다. 이 보고서에서 대표적인 결과의 국립 연구소의 전염병, 도쿄, 일본, 윤리 위원회의 승인으로 수행 되었고 동의 서 면으로 사용 하는 건강 한 성인 자원 봉사자에서 PBMCs의 샘플링 얻은 각 참가자에서 윤리 위원회 승인 양식을 사용 하 여. 1. 뇌관 디자인 CDNA는 면역 글로불린을 증폭 하는 보편적인 앞으로 뇌관 디자인에서 PCR 뇌관, 5′-경주11,12 및 스마트 PCR13 기법에서 사용 되는 바이어스 없이 mRNA. 면역 글로불린 VH 유전자 증폭에 대 한 역방향 뇌관8,14 (그림 1A)로 일정 지역에서 면역 글로불린 클래스 특정 시퀀스를 디자인 합니다.참고: 다중 태그 시퀀스 다른 샘플 소스에서 라이브러리 분자를이 뇌관에 추가할 수 있습니다. 중첩된 한 PCR 위한 시퀀스 또한 추가할 수 있습니다,15키트 사용 설명서에 따라. 유니버설 앞으로 뇌관 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′ 마우스 면역 글로불린 (Ref.8)에 대 한 역방향 뇌관 IgM_CH1: CACCAGATTCTTATCAGACAGGGGGCTCTC-3-5′ ‘ IgG1_CH1: CATCCCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTTGG-3-5’ ‘ IgG2c_CH1: GTACCTCCACACACAGGGGCCAGTGGATAG-3-5’ ‘ IgG3_CH1: 5′-ATGTGTCACTGCAGCCAGGGACCAAGGGA-3′ IgA_CH1: 5′-GAATCAGGCAGCCGATTATCACGGGATCAC-3′ Igκ_CH1: GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG-3-5’ ‘ Igλ_CH1: CTBGAGCTCYTCAGRGGAAGGTGGAAACA-3-5’ ‘ 인간의 면역 글로불린 (Ref.14)에 대 한 역방향 뇌관 IgM_CH1: GGGAATTCTCACAGGAGACG-3-5’ ‘ IgG_CH1: AAGACCGATGGGCCCTTG-3-5’ ‘ IgD_CH1: GGGTGTCTGCACCCTGATA-3-5’ ‘ IgA_CH1: GAAGACCTTGGGGCTGGT-3-5’ ‘ IgE1_CH1: GAAGACGGATGGGCTCTGT-3-5’ ‘ IgE2_CH1: TTGCAGCAGCGGGTCAAGGG-3-5’ ‘ Igκ_CH1: TGCTCATCAGATGGCGGGAAGAT-3-5’ ‘ Igλ_CH1: AGAGGAGGGCGGGAACAGAGTGA-3-5’ ‘ 표 1: 면역 글로불린의 PCR 확대를 위한 뇌관 순서 2. 핵 산 격리 면역 세포와 조직에서 참고: 아래에 주어진 프로시저 마우스 비장에서 핵 산 추출입니다. 그러나, 그것은 다른 면역 조직 및 림프절 등 인간의 세포 또는 말 초 혈액 단 세포 (PBMCs) (그림 1B)에 적용 됩니다. Dissect는 조직, 예를 들어, 8 주 된 C57BL/6 마우스에서 비장 하 고 분산 된 세포를 PBS 버퍼의 2 mL와 스테인레스 스틸 메쉬 (200에서 400 µ m) 통과. 세포 현 탁 액 2.0 mL microcentrifuge 튜브, 그리고 600 × g 및 4 ˚C에서 5 분 동안 원심 분리기에 전송. 폐기는 상쾌한. 펠 릿에 ACK lysing 버퍼 (150mm NH4Cl, 1 m m KHCO3, 0.1 m m 나2EDTA, pH 7.2)의 800 µ L을 추가 하 고 조직에서 붉은 혈액 세포를 lyse를 2 분 동안 얼음에 품 어. 2 mL PBS 3의와 함께 조직 세포를 씻어 x, 600 × g 및 4 ˚C에서 5 분 동안 원심 분리에 의해 따라. 펠 릿, 페 놀/guanidine isothiocyanate 시 약의 800 µ L 추가 소용돌이 철저 하 게, 그리고 5 분 동안 약 25 ˚C에서 품 어. 클로 프롬 (200 µ L)를 추가, 15 수동으로 흔들어 s, 그리고 다음 2 분 약 25 ˚C에서 품 어. 12000 × g 25 ˚C에 15 분 동안 원심 분리에 의해 단계를 구분 하 고 신선한 튜브를 위 수성 단계를 전송 합니다. 70% 에탄올, 짧게 소용돌이의 한 볼륨을 추가 하 고 실리 카 스핀 열을 적용. 물 30-100 µ L로 RNA elute Fluorometer (테이블의 재료)를 사용 하 여 초기 RNA 농도 quantitate -80 ˚C에서 순화 된 RNA를 저장 합니다. 3. cDNA 합성 및 PCR 증폭 참고: 아래 설명 하는 방법은 5′-경주11,12 , 스마트 PCR 기법13에 근거한 다. 세부 사항 및 반응의 최적화 키트 15의 설명서에 설명 되어 있습니다. 마우스의 면역에 대 한 시작 물자는 단계의 2.10 샘플. 인간의 면역에 대 한 시작 물자는 샘플에서 인간의 조직, 출 PBMC, 처리 단계 2.3 2.10에서에서 설명한 대로. 5’-레이스 CD 뇌관 (올리고-dT-포함) 및 제조 업체의 지침15에 따라 스마트 PCR oligonucleotide (자료 테이블)를 사용 하 여 전체 RNA 템플릿의 10 µ g에 2에서 첫번째 물가 cDNA를 음성 합성. 마우스 면역, 보편적인 앞으로 뇌관 및 면역 글로불린 클래스 전용 역방향 뇌관 (표 1)를 사용 하 여 고 충실도 DNA 중 합 효소로 cDNA PCR 증폭에 대 한 로 열 순환 조건 설정: 2 분, 그리고 30 대 94 ˚C의 40 주기 94 ˚C s, 30 59 ˚C s, 그리고 30 대 72 ˚C s, 5 분 동안 72 ˚C에서 최종 확장 단계 뒤.참고: 일반적인 실험 증폭 IgM, IgG1, IgG2c, Igk Igl 면역 글로불린 클래스를 보고 순진한, 종속 Th1 및 Th2 의존 B 세포 (그림 3). 인간의 면역 글로불린, 1세인트 태그 시퀀스와 유니버설 앞으로 뇌관 및 면역 글로불린 클래스 전용 역방향 뇌관 (표 1)를 사용 하 여 PCR을 수행 합니다. 2차 PCR에 의해 각 샘플에 대 한 인덱스 시퀀스가 포함 인덱스 시퀀스 뇌관을 사용 하 여. 다음과 PCR와 Taq 중 합 효소를 사용 하 여: 2 분, 21 주기 (1세인트 PCR) 또는 30 94 ˚C에서 32 주기 (2차 PCR) 94 ˚C s, 30 59 ˚C s, 72 ˚C 30 s.참고: 일반적인 실험 증폭 IgM, IgD, IgG (IgG1, IgG2, IgG3와 IgG4), IgA (IgA1 및 IgA2), IgE, Igk Igl 면역 글로불린 클래스 모든 B 세포 인구 (그림 4)을 보면. Electrophorese는 agarose 젤에 PCR 제품 그리고 실리 카 막 스핀-열을 사용 하 여 600 ~ 800 bp 파편을 정화. 3.2.1 또는 2 %agarose 젤에 3.2.2에서 샘플 electrophorese UV transilluminator에 DNA 밴드를 구상 하 고 600 ~ 800 사이 광범위 한 밴드를 포함 하는 젤-슬라이스를 삭제할 혈압. 젤 조각의 10 밀리 그램 당 막 바인딩 솔루션의 10 mL를 추가 합니다. 혼합 하 고 젤 슬라이스 완전히 해산 될 때까지 50-65 ° C에서 품 어. 실리 카 막 스핀-열에 젤 솔루션을 전송 합니다. 버퍼를 세척을 한 번 세척 하 고 DNA nuclease 무료 물 (자료 테이블)의 50 mL와 함께 elute. NGS 시퀀싱에 대 한 동일 금액의 각 면역 글로불린 클래스에서 fluorometer 및 수영장 amplicons와 순화 amplicons 계량.참고: 일반적으로 2-10 mg amplicon DNA는 각 면역 글로불린 클래스에 대 한 복구 했습니다. 동등 하 게 증가 50 mL 솔루션 10-20 ng/mL에 DNA를 포함 하 게 DNA에에서 각 샘플 솔루션을 혼합. 크기와 DNA 크기 칩 (자료 테이블) 마이크로 모 세관 근거한 전기 이동 법을 사용 하 여 라이브러리의 농도 결정 합니다. -20 ° c.에 라이브러리를 저장 4. NGS 시퀀싱 라이브러리의 시퀀싱 실행된 지정 샘플 이름, 인덱스 정보에 대 한 SampleSheet.cvs를 생성 하 고.fastq 파일만을 지시. 해빙 시 카트리지 (자료 테이블)와 라이브러리. 0.2 N NaOH를 확인 하 고 원하는 어 금 니 농도를 라이브러리를 희석. 린스와 건조 흐름 셀. 시 약 카트리지의 우물에 희석 및 변성 라이브러리 솔루션의 600 mL를 추가 합니다. 시퀀싱 실행을 시작 합니다. 5입니다. NGS 데이터의 품질 관리 16″FASTX-도구 키트” 사용 하 여 FASTQ 데이터의 품질 관리를 수행 합니다.참고 사용 되는 매개 변수 설정의 기본적인 예는 다음과 같습니다.:fastq_quality_trimmer-v t 20-200 l-i [InFilename.fastq]-o [InFilename.fastq]fastq_quality_filter-v-q 20-p 80-i [InFilename.fastq]-o [InFilename.fastq]fastx_reverse_complement-v-i [InFilename.fastq]-o [InFilename.fastq] 다음 명령을 사용 하 여 “fasta 핵 산 (.fna)”을 출력 파일 포맷:fastq_to_fasta-v-n-i [InFilename.fastq]-o [InFilename.fna] 6. 추출 및.fna 데이터에서 면역 글로불린 시퀀스의 분석 참고: 예제 프로그램은 유닉스 환경에서 구현 되었다. 로 예를 들어 참조 성능 운영 체제와 하드웨어 환경에 따라 달라질 수 있습니다 때문에 그들을 사용 하십시오. 저자는 오류 또는 누락에 대 한 어떤 책임을 허용 하지 않습니다. 프로그래밍 언어, 펄17, R18및 필요한 모듈 인용된 웹사이트에 지시에 따라 설치 될 필요가 있다. IgBLAST 프로그램은 적절 한 웹사이트19,20에 대 한 지침에 따라 설치 될 필요가 있다. Https://github.com/KzPipeLine/KzPipeLine에서의 레 퍼 토리 분석에 대 한 사내 프로그램 다음 예제를 다운로드:03_PipeLine_Mouse.zip; 마우스 항 체 시퀀스의 분석에 대 한 예제 프로그램의 집합입니다.05_PipeLine_Human.zip; 인간 항 체 시퀀스의 분석에 대 한 예제 프로그램의 집합입니다. 항 체 읽고 시퀀스 데이터 추출: 각 면역 글로불린 일정 지역 (표 2)에 서명 시퀀스를 검색 Perl 프로그램에 의해 데이터 (.fna)에서 각 Ig 클래스의 면역 글로불린 (Ig) 시퀀스를 추출. 마우스 면역 글로불린 무거운 체인 (IgH) 유전자에 대 한 다음 명령으로 읽기를 추출:$ 펄 01_KzMFTIgCmgggaNtdVer3_Kz160607.pl [입력 파일 이름] [출력 파일 이름 (접미사)] 다음 명령을 사용 하 여 마우스 면역 글로불린 경 쇄 (IgL) 유전자 추출 읽기:$ 펄 01_KzMFTCkltNtdVer1_170810.pl [입력 파일 이름] [출력 파일 이름 (접미사)] 인간의 면역 글로불린 무거운 체인 (IgH) 유전자에 대 한 다음 명령으로 읽기를 추출:$ 펄 01_KzMfHuIgHCmgadeNtdVer1_Kz180312.pl [입력 파일 이름] [출력 파일 이름 (접미사)] 인간의 면역 글로불린 경 쇄 (IgL) 유전자에 대 한 다음 명령으로 읽기를 추출:$ 펄 01_KzMfHuIgCkltNtd_180316.pl [입력 파일 이름] [출력 파일 이름 (접미사)] 주석을 추가 하 고 V (D) J 유전자 재조합의 생산성을 확인 하십시오.참고: 아래 설명 하는 방법을 순서에 V (D) J 유전자 세그먼트의 주석에 대 한 독립 실행형 IgBLAST19 를 이용 한다. V (D) J 유전자에 대 한 데이터베이스 및 IgBLAST에 대 한 매개 변수 설정이 설명된20으로 설정 합니다. 다음 명령을 사용 하 여 마우스 면역 글로불린 무거운 체인 (IgH) 유전자를 주석:$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-유기 체 마우스-domain_system imgt-쿼리. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/mouse_gl.aux-show_translation-outfmt 7 >>. / $OutName 다음 명령을 사용 하 여 마우스 면역 글로불린 경 쇄 (IgL) 유전자를 주석:$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-유기 체 마우스-domain_system imgt-쿼리. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/mouse_gl.aux-show_translation-outfmt 7 >>. / $OutName 다음 명령을 사용 하 여 인간의 면역 글로불린 무거운 체인 (IgH) 유전자를 주석:$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-유기 체 인간-domain_system imgt-쿼리. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/Human_gl.aux-show_translation-outfmt 7 >>. / $OutName 다음 명령을 사용 하 여 인간의 면역 글로불린 경 쇄 (IgL) 유전자를 주석:$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-유기 체 인간-domain_system imgt-쿼리. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/human_gl.aux-show_translation-outfmt 7 >>. / $OutName 항 체 레 퍼 토리의 글로벌 기능을 시각화. 다음 명령을 사용 하 여 마우스 IgH 레 퍼 토리를 시각화:$ . 00a1_3DView_MoIgH_Kz180406.sh참고: 입력된 파일은 filename.fna (시퀀스 데이터), 선호 6.2.1에서 출력 파일. 이 파일은 “filename” 이라는 하위 디렉토리 (폴더)에 배치 해야 합니다. 쉘 스크립트의 50 라인에서 Para_4에 대 한 “파일 이름”을 할당 합니다. 다음 명령을 사용 하 여 인간의 IgH 레 퍼 토리를 시각화:$ . 00a1_3DView_HuIgH_Kz180411.sh참고: 입력된 파일 filename.fna 시퀀스 데이터, 선호 6.2.3의 출력 파일입니다. 이 파일을 배치 해야 하위 디렉토리 (폴더)에 그 이름은 “파일 이름”. 쉘 스크립트의 46 라인에서 Para_4에 대 한 “파일 이름”을 할당 합니다. 다음 명령을 사용 하 여 마우스 IgL 레 퍼 토리를 시각화:$ . 00_2DViewS_MoIgL_Kz180406.sh참고:이 파이프라인 Igk와 Igl 처리 됩니다 수반. 입력된 파일은 filename.fna (시퀀스 데이터), 선호 6.2.2에서 출력 파일. 이 파일은 “filename” 이라는 하위 디렉토리 (폴더)에 배치 해야 합니다. 쉘 스크립트의 라인 53, “파일 이름” Para_4에 대 한 할당 합니다. 출력 파일의 이름을 “_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt”로 끝나는 2 차원 막대 그래프 (그림 3, IgL)에 대 한 좌표를 제공합니다. 다음 명령을 사용 하 여 인간의 IgL 레 퍼 토리를 시각화:$ . 00_2DView_HuIgL_Kz180319.sh참고:이 파이프라인 Igk와 Igl 처리 됩니다 수반. 입력된 파일 filename.fna 시퀀스 데이터, 선호 6.2.4의 출력 파일입니다. 이 파일은 “filename” 이라는 하위 디렉토리 (폴더)에 배치 해야 합니다. 쉘 스크립트의 라인 53, “파일 이름” Para_4에 대 한 할당 합니다. 출력 파일 이름 “_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt”로 끝나는 2 차원 막대 그래프 (그림 4, IgL)에 대 한 좌표를 제공 합니다.
Representative Results
마우스의 항 체 레파토리 전체적으로 murine 항 체 레 퍼 토리의 관점은 세포 또는 비장, 골 수, 림프절, 또는 혈액 같은 조직에서 얻어질 수 있다. 그림 3 에서 순진한 마우스 비장 경 쇄 (IgL) 레파토리 IgM, IgG1, IgG2c, 및 면역 글로불린의 대표적인 결과 보여준다. 읽기 숫자의 요약 표 3에 표시 됩니다. 예를 들어 166,175/475,144 읽기 포함 IgM 특정 서명 순서 (표 2) 그리고 133,371/166,175 읽기 VDJ 생산적 IgBLAST19유추 했다. 그림 3 은 3D-VDJ-음모, 각 볼의 크기 읽기;의 상대적 수를 나타냅니다에 의해 VDJ 재배열의 레 퍼 토리 프로 파일 즉, 모든 B 세포에서 항 체 mRNAs의 수입니다. 110 IGHV, 12 IGHD, 및 4 IGHJ, 염색체에 그들의 순서에 맞게 정렬 됩니다 3 차원 메쉬에 의하여 이루어져 있다. 또한, 무슨 IgBLAST에 의해 할당 된 유전자는 투자 골에서 7,215 노드를 야 기한 각 IGHV, IGHD 및 IGHJ 라인에 대 한 마지막 위치에 별도로 수집 했다. 또한, 그림 3 에 2D VJ 작 보여주는 IgL 레 퍼 토리에 VJ 재배치의 프로필 표시. 이 음모에 각 막대의 길이 읽기의 상대적 수를 나타냅니다. X 축 101 IGLVκ와 3 IGLVλ 유전자를 나타내고 y 축은 4 IGLJκ와 3 IGLJλ 유전자를 나타냅니다. Unannotated V-와 J-유전자 오른쪽 경계선에 표시 됩니다. Complementarity 결정 지역 3 (CDR3) 항 원 묶는 특이성의 대부분을 일으키 다, 이러한 생산성 읽기의 순서는 주어진 IgBLAST 출력에. 시퀀스를 통계적으로 분석 될 수 있다 CDR3 이전8,10설명으로 생물 학적 또는 기술적인 복제를 포함 하 여. 인간 항 체 레파토리 전체적으로 인간 항 체 레 퍼 토리의 관점에서 다양 한 말 초 혈액 단 세포 (PBMCs)를 포함 하 여 조직 또는 병 적인 조직을 분석할 수 있습니다. 그림 4 는 대표적인 결과의 IgM, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4) 총, 총 (IgA1 및 IgA2) IgA, IgD, IgE 및 IgL 정상 PBMCs에서 레파토리. 읽기 숫자의 요약 표 3에 표시 됩니다. 예를 들어 90,238/1,582,754 읽기 IgM 특정 서명 시퀀스를 포함 하 고 67,896/90,238 읽기 VDJ 생산성이 있었다. VDJ 재배열의 레 퍼 토리 프로 파일에 3D-VDJ-각 볼의 크기 읽기;의 상대적 수를 나타냅니다 표시 됩니다. 즉, 전체 PBMCs (그림 4)에서 항 체 mRNAs의 수입니다. 3 차원 메쉬 구성 56 IGHV, 27 IGHD 및 6 IGHJ, 염색체에 나타나는 순서로 정렬 됩니다. 또한, 무슨 IgBLAST에 의해 할당 된 유전자는 투자 골에서 11,172 노드를 야 기한 각 IGHV, IGHD 및 IGHJ 라인에 대 한 마지막 위치에 별도로 표시 됩니다. IgL 레 퍼 토리에 VJ 재배치의 프로필 2D-VJ-음모 각 막대의 길이 읽기 (그림 4)의 상대적 수를 나타냅니다에서 묘사 된다. X 축 41 IGLVκ와 32 IGLVλ 유전자를 나타내고 y 5 IGLJκ 5 IGLJλ 유전자를 나타냅니다. 유엔-주석 V-와 J-유전자 오른쪽 경계선에 표시 됩니다. 인간의 CDR3 시퀀스 IgBLAST에 주어진 출력 하 고 앞에서 설명한8,10통계적으로 분석 될 수 있다. 면역 글로불린 클래스 감각 Antisense 마우스의 면역 글로불린 중 연쇄 (C57BL/6) IgM AGTCAGTCCTTCCCAAATGTC GACATTTGGGAAGGACTGACT IgG1 AAAACGACACCCCCATCTGTC GACAGATGGGGGTGTCGTTTT (IgG1 변형) AAAACAACACCCCCATCAGTC GACTGATGGGGGTGTTGTTTT IgG2c AAAACAACAGCCCCATCGGTC GACCGATGGGGCTGTTGTTTT IgG3 GTGATCCCGTGATAATCGGCT AGCCGATTATCACGGGATCAC IgA TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG 마우스의 면역 글로불린 경 쇄 (C57BL/6) Igκ CTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGC GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG Igλ1 TGTTTCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCGAG CTCGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGAAACA Igλ2 TGTTTCCACCTTCCTCTGAGGAGCTCAAG CTTGAGCTCCTCAGAGGAAGGTGGAAACA Igλ3 TGTTTCCACCTTCCCCTGAGGAGCTCCAG CTGGAGCTCCTCAGGGGAAGGTGGAAACA Igλ4 TGTTCCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCAAG CTTGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGGAACA 인간 면역 글로불린 중 연쇄 IgM GGGAGTGCATCCGCCCCAAC GTTGGGGCGGATGCACTCCC IgG GCTTCCACCAAGGGCCCATC GATGGGCCCTTGGTGGAAGC IgA GCATCCCCGACCAGCCCCAA GACCGATGGGGCTGTTGTTTT IgD GCACCCACCAAGGCTCCGGA TCCGGAGCCTTGGTGGGTGC IgE GCCTCCACACAGAGCCCATC GATGGGCTCTGTGTGGAGGC 인간 면역 글로불린 경 쇄 Igκ ACTGTGGCTGCACCATCTGC GCAGATGGTGCAGCCACAGT Igλ1, 2, 6 GTCACTCTGTTCCCGCCCTC GAGGGCGGGAACAGAGTGAC Igλ3, 7 GTCACTCTGTTCCCACCCTC GAGGGTGGGAACAGAGTGAC 면역 글로불린 서명 시퀀스의 표 2: 요약 마우스 고등학교 총 읽습니다 IgM IgG1 IgG2c 입력 475,144 IgC를 포함 하 166,175 229,671 36,628 VDJ 생산성 133,371 196,583 31,446 마우스 IgL 총 읽습니다 IgKappa IgLambda 입력 527,668 IgC를 포함 하 178,948 21,446 VJ 생산성 160,924 16,988 인간 고등학교 총 읽습니다 IgM IgG IgA IgD IgE 입력 1,582,754 IgC를 포함 하 90,238 5,298 94,061 75,549 2,932 VDJ 생산성 67,896 2,775 78,203 56,495 3 인간의 IgL 총 읽습니다 IgKappa IgLambda 입력 1,582,754 IgC를 포함 하 120,316 64,148 VJ 생산성 97,169 52,324 실험에서 읽기 숫자의 표 3: 요약 그림 1: 개별 생쥐에서 항 체 레파토리를 분석 하기 위한 연속 전략의 도식 대표. (면역 세포 또는 조직에서 A) 총 RNA 리버스 변하게 되었고 앞으로 보편적인 뇌관을 사용 하 여 PCR 증폭 하 고 면역 글로불린 클래스별 반전 뇌관. 각 면역 글로불린 클래스에서 amplicons 풀링된 되었고-세대 시퀀싱에 대 한 렌더링. (B)는 생물 복제와 같은 C57BL/6 쥐에서 spleens 다음과 같이 취급 했다: 총 RNAs 비장 샘플에서 순화 했다 그리고 cDNAs 5′-경주 보편적인 뇌관 및 항 체 클래스 특정 뇌관을 사용 하 여에 의해 증폭 했다. 그들은 다음 라벨 개별 쥐를 위한 뇌관으로 차세대 시퀀싱에 대 한 렌더링 했다. 그림의 부품은8 동의에서 적응입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 2: 개별 생쥐에서 항 체 레파토리를 분석 하기 위한 데이터 처리 순서도의 도식. 차세대 시퀀싱 후 얻은 Amplicon 읽기는 다음과 같이 처리 했다: (1) 읽기 시퀀스 항 체 클래스 관련 서명 시퀀스;의 존재에 대 한 확인 (2) 시퀀스 v, D, 시험 되었다 그리고 J 유전자 조각 IMGT/HighV-퀘스트 및 IgBLAST;를 사용 하 여 (3) 시퀀스 생산적인 VDJ 접합을 포함 하는 수집 된; (4) 이러한 시퀀스 사용 되었다 CDR3, 전체 레 퍼 토리 기능의 분석 등 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3: 마우스 항 체 레파토리에 대 한 글로벌 데이터 시각화. 각 항 체 클래스의 전체 레 퍼 토리 프로필 3D VDJ 음모에 의해 구상 했다. X 축 110 IGHV 유전자를 염색체에 지시를 나타냅니다. y-축 및 z 축 나타냅니다 12 IGHD 4 IGHJ 유전자, 각각. 각 노드에서 분야의 볼륨 읽기 수를 나타냅니다. 빨간 분야: 유엔 주석 V, D 및 J 유전자. IgL 읽기 배포판에 2D-VJ-각 막대의 길이 읽기의 상대적 수를 나타냅니다 표시 됩니다. X 축 x IGLVκ와 3 x IGLVλ 유전자, 101 나타내고 y 축은 4 x IGLJκ와 3 x IGLJλ 유전자를 나타냅니다. 유엔-주석 V와 J 유전자 오른쪽 경계선에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 4: 인간 항 체 레파토리에 대 한 글로벌 데이터 시각화. 각 항 체 클래스의 전체 레 퍼 토리 프로필 3D VDJ 음모에 의해 구상 했다. X 축 56 IGHV 유전자를 염색체에 지시를 나타냅니다. y-축 및 z 축 나타냅니다 27 IGHD 및 6 IGHJ 유전자, 각각. 각 노드에서 분야의 볼륨 읽기 수를 나타냅니다. 빨간 분야: 유엔 주석 V, D 및 J 유전자. IgL 읽기 2D-VJ-줄거리 각 막대의 길이 읽기의 상대적 수를 나타냅니다에 짓고 있다. X 축 IGLVκ 32 x IGLVλ 유전자, x 41 나타내고 y IGLJκ과 x IGLJλ 유전자 5 x 5를 나타냅니다. 유엔-주석 V-와 J-유전자 오른쪽 경계선에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
여기에 설명 된 메서드는 5′-경주 메서드를 사용 하 여 증폭 하는 항 체 RNA에 대 한 NGS를 활용 합니다. 타락 한 5′-VH 유전자 뇌관을 사용 하는 방법을 달리 각 항 체 클래스의 mRNAs 유니버설 앞으로 뇌관을 사용 하 여 균등 하 게 증폭 됩니다. 또한, 상수 지역 1 (CH1) 항 체 유전자의 특정 센스 프라이 머를 사용 하 여 특정 면역 글로불린 클래스의 프로 파일링 레 퍼 토리 수 있습니다. 이 매우 순진한 면역된 레파토리8,9비교 뿐만 아니라 클래스 특정 항 체 응답을 해 부에 대 한 도움이 됩니다.
방법의 가장 가능성이 함정이 증폭된 면역 글로불린 메시지의 부족 이다. 실질적으로이 프로토콜에 의해 얻은 항 체 레 퍼 토리의 깊이 3.1, 3.2 단계에 설명 된 PCR 증폭에 따라 달라 집니다. 레 퍼 토리 깊이 제대로 얻지 템플릿 cDNA 및 단계 3.2.1 또는 3.2.2 프라이 머의 비율 변경이 좋습니다.
일반적으로, 항 체 읽기 제작한 NGS의 약 20%는 모호한 시퀀스21. 도 설립 “보정 방법”, 5-10% 유지 모호한3. 우리, 따라서 순서를 분석 하 고 면역 글로불린 일정 지역 (CμH1, Cγ1H1, Cγ2cH1, 등)에 해당 하는 서명 시퀀스를 포함 하는 원시 읽기를 필터링. 따라서 신체적인 하이퍼 돌연변이의 분석 주의 시험이 필요합니다.
이 방법의 제한 사항 중 하나는 면역 글로불린 무거운 이며 가벼운 체인 쌍은 유추 될 수 없습니다. 따라서이 방법에 의해 얻은 레 퍼 토리 보기 전체적 아니다. 그러나, 데이터10의 통계 분석에 의해 일류 쌍을 가능 하다. 또한, 소설 메서드 면역 글로불린 쌍은 순서를 보고 최근3,4.
출력.fna 데이터에서 면역 글로불린 시퀀스 면역 글로불린 유전자 서명 시퀀스의 존재에 따라 추출 되었다. V, D 및 J 유전자 세그먼트 했다 다음 주석 및 V (D) J 재배열의 생산성 평가 됐다. Complementarity 결정 지역 3 (CDR3) 시퀀스 또한 주석 했다. .Fna 데이터에 면역 글로불린 시퀀스의 체계적인 시험이 유용 IMGT/HighV-퀘스트 서버22,,2324에 의해 제공 되었다. 그러나, 자동화 된 처리 파이프라인을 구축 큰 실험 데이터를 분석 하는 장점이 있다. 각 목적을 위해 사용자 지정 파이프라인은 독립 실행형 IgBLAST 프로토콜19를 사용 하 여 설정 가능 합니다. 이 방법은 기본적인 프로그래밍 능력을 요구 하지만 면역 시스템의 상세한 분석에 매우 유용. 설명 된 파이프라인은 사용자 지정된 프로토콜 (그림 2)의 예입니다.
항 체의 수는 항 체 항 체 성분에 항 체 시스템의 반영 샘플에서 RNAs의 금액에 비례한 주어진 시간 포인트5,,825읽습니다. 여기 설명 하는 방법을 연구 프로그램8,,1826를 사용 하 여 레 퍼 토리는 항 체의 V (D) J 헌법의 조류의 눈 보기를 제공 합니다.
개별 순진한 쥐의 IgM 항 체 레파토리의 글로벌 보기 IgG1 또는 IgG2c8의 그에 비해 매우 보존된 VDJ 프로 파일을 공개 했다. 그것은 미 숙 zebrafish의 VDJ 조합 매우 진부한9는 알려졌다. 반면, 인간의 VDJ 조합 될 매우 괴상 한6을 보고 있습니다. 순진한 B 셀에는 높은 보존된 결정적 VDJ-프로필은 자동 항 본문에 제시 된 아마도 비우는 VDJ 재배열에 의해 생성 된 또는 부정적인 선택. 예를 들어 IGHV11-2은 태아 IgM 레 퍼 토리27 에 우선적으로 표현 되며이 우위 노화 적혈구27에 대 한 IGHV11-2의 autoreactivity에 기인 된다. 흥미롭게도, IGHV11-2 순진한 IgM8의 이전 게시 우리의 분석에 가장 일반적인 주요 레 퍼 토리도 했다.
여기에 설명 된 방법은 까지의 개별 기관, 주요 항 체 레파토리8의 실수로 누락을 피하에 생성 된 항 체 레 퍼 토리 공간을 분석 하 여 항 체 항 원 반응 레파토리를 해독 하는 데 유용 10. 이 메서드는 또한 것을 용이 하 게 상세한 항 체 네트워크 역동성의 시험 새로 신흥에 대 한 보호 항 체의 발견을 가속 수 있습니다 병원 체.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품 아메드 보조금 번호 JP18fk0108011 아래에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (코와 SI) 및 JP18fm0208002 (TS, 코, 그리고 요), 그리고 코를 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 (15 K 15159)에서 특정. 우리는 귀중 한 기술 지원에 대 한 사유리 야마구치와 리코 사사키 감사합니다. 우리는 영어 편집 Editage (www.editage.jp)를 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| 0.2 mL Strip Tubes | Thermo Fisher Scientific | AB0452 | 120 strips |
| 100 bp DNA Ladder | TOYOBO | DNA-035 | 0.5 mL |
| 2100 Bioanalyzer Systems | Agilent Technologies | G2939BA /2100 | |
| Acetic Acid | Wako | 017-00256 | 500 mL |
| Agarose, NuSieve GTG | Lonza | 50084 | |
| Ammonium Chloride | Wako | 017-02995 | 500 g |
| Chloroform | Wako | 038-02606 | 500 mL |
| Dulbecco's PBS (-)“Nissui” | NISSUI | 08192 | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (2NA) | Wako | 345-01865 | 500 g |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | 50/Case |
| ling lock tube 1.7 mL | BM EQUIPMENT | BM-15 | |
| ling lock tube 2.0 mL | BM EQUIPMENT | BM-20 | |
| MiSeq Reagent Kit v2 | illumina | MS-102-2003 | 500 cycles |
| MiSeq System | illumina | SY-410-1003 | |
| NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Potassium Hydrogen Carbonate | Wako | 166-03275 | 500 g |
| PureLink RNA Mini Kit | life technologies | 12183018A | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | 500 assays |
| SMARTer RACE 5’/3’ Kit | Clontech | 634858 | |
| TaKaRa Ex Taq Hot Start Version | Takara Bio Inc. | RR006A | |
| Trizma base | Sigma | T6066 | 1 kg |
| TRIzol Reagent | AmbionThermo Fisher Scientific | 15596026 | 100 mL |
| Ultra Clear qPCR Caps | Thermo Fisher Scientific | AB0866 | 120 strips |
| UltraPure Ethidium Bromide | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 |
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Citazione di questo articolo
Sun, L., Kono, N., Toh, H., Xue, H., Sano, K., Suzuki, T., Ainai, A., Orba, Y., Yamagishi, J., Hasegawa, H., Takahashi, Y., Itamura, S., Ohnishi, K. Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (145), e58804, doi:10.3791/58804 (2019).