Analyse van Shear Flow-geïnduceerde migratie van RattenUitrustingen Marginal Zone B cellen In Vitro
Summary
Marginaal zone B cellen (MZBs) reageren op de kracht van shear stroom door heroriëntering op hun migratiepad van de stroom. Dit protocol laat zien hoe om te registreren en analyseren van het migratie met behulp van een fluidics eenheid, pomp, Microscoop imaging systeem en vrije software.
Abstract
Marginaal zone B cellen (MZBs) zijn een bevolking van B-cellen die zich bevinden in de muis milt marginale zones die follikels omhullen. Om de follikels te halen, moet MZBs migreren van de shear kracht van de bloedstroom. Wij presenteren hier een methode voor het analyseren van deze stroom-geïnduceerde MZB migratie in vitro. Ten eerste, MZBs zijn geïsoleerd van de milt van de muis. Ten tweede, MZBs zijn verrekend op integrine liganden in flow kamer dia’s blootgesteld als u wilt schuintrekken stroom en beeld onder een Microscoop tijdens de migratie. Ten derde, beelden van de migratie MZBs worden verwerkt met behulp van de automatische cel van MTrack2 plugin voor ImageJ bijhouden, en de resulterende cel tracks worden gekwantificeerd aan de hand van de Ibidi chemotaxis tool. De migratiegegevens onthullen hoe snel de cellen verplaatst, hoe vaak ze richting wijzigen of de shear stroom vector is van invloed op de richting van hun migratie en welke integrine liganden zijn betrokken. Hoewel we MZBs gebruiken, kan de methode gemakkelijk worden aangepast voor het analyseren van de migratie van eventuele leukocyte die op de kracht van shear stroom reageert.
Introduction
Immune cellen zijn de meest motile cellen in het menselijk lichaam en vaak moeten vechten met schuintrekken kracht van de stroom van bloed en lymfe. Er zijn echter relatief weinig studies over schuintrekken kracht-geïnduceerde migratie van leukocyten1,2,3,4,5. Wij presenteren hier een betrouwbare en kwantitatieve protocol om te analyseren van de reactie van een immuun cel op stroom in vitro. Uitvoeren van de test vereist geen fabricage van onderdelen, en alle apparatuur en verbruiksartikelen zijn commercieel verkrijgbaar. Het protocol, met inbegrip van cel zuivering en migratie analyse, kan worden uitgevoerd in een enkele dag. Ten slotte, hoewel we beschrijven de migratie van marginale zone B cellen (MZBs), het protocol kan aangepast worden voor het analyseren van migratie tegen stroom van andere soorten immuuncellen. Daarom is het haalbaar is om met deze test kunt u systematisch analyseren een breed scala van leukocyten met een uitgebreid panel van voorwaarden.
MZBs zijn een bevolking van B-cellen, die in de muis, alleen in de milt en de shuttle gevonden worden tussen het interieur van de follikels en de marginale zones6,7,8,9. De marginale zone is een laag van immune cellen ongeveer 5-10 cellen dik. De cellaag omhult de follikel en bestaat voornamelijk uit MZBs en macrofagen maar ook invariant natuurlijke killer T (iNKT) cellen, dendritische cellen (DC’s) en neutrofielen, o.a.10. De cellen in de marginale zone worden blootgesteld aan unidirectionele bloedstroom afkomstig van milt slagaders die uitkomen in een marginale sinus rondom de follikel. Het bloed stroomt uit gaten in de marginale sinus via de marginale zone en vervolgens verzameld in veneuze sinussen in het rood vruchtvlees en teruggezet naar de omloop11. De vrije stroom van bloed wast over de MZBs en hen blootstelt aan antigenen in het bloed vervoerd. De MZBs voeren het antigeen in de follikel door automatisch pendelen tussen de marginale zone en binnenkant van de follikel, die niet is blootgesteld aan bloed. Dus, als MZBs shuttle naar de follikel, moeten ze migreren van de shear kracht van de bloed stroom12 (figuur 1A).
In dit protocol, beschrijven we het kwantitatief bepalen hoe immuun cellen zoals MZBs reageren op geen stroom of de hoge stroom in vitro, om te laten zien hoe ze zijn geprogrammeerd om te migreren van in vivo. MZBs zijn in de eerste stap gezuiverd van de milt van een muis met behulp van magnetische kralen gekoppeld aan antilichamen van commercieel beschikbare kits. De vers geïsoleerde MZBs zijn ingevoerd in het putje van een stroom kamer dia, toegestaan om af te wikkelen naar integrine liganden en blootgesteld aan de stroom van migratie buffer met behulp van een pompsysteem (figuur 2A). De cellen zijn beeld met behulp van een systeem van tijd-tijdspanne videomicroscopie. De beelden worden vervolgens verwerkt voor de analyse met een gratis ImageJ plugin, MTrack213,14, automatisch bijhouden van de cellen. Tracks kunnen vervolgens worden gekwantificeerd met de gratis Ibidi Chemotaxis gereedschap15 verschillende parameters zoals snelheid, rechtheid en migratie index bepalen. Deze waarden kunnen worden gebruikt om te bepalen van de gevolgen van migratie remmers, cel stimulatoren chemokines en andere migratie-op het gebied van chemische stoffen voor de migratie van de shear-flow geïnduceerde om te begrijpen van de krachten die immuun cel beweging in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een methode voor het analyseren van de migratie van de cellen die ontdekken de kracht van shear stroom en reageren door een wijziging van hun migratie. Een analyse van de MZBs bleek dat MZBs migreren spontaan op ICAM-1 en in aanwezigheid van de stroom, zal migreren van de stroom. In onze eerdere werk toonden we dat MZBs niet van de stroom op VCAM-1 migreren, maar in plaats daarvan vaste in plaats blijven. De lymfkliertest milt marginale zone bevat voornamelijk ICAM-1, terwijl het rode vruchtvlees zowe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door subsidies van de “Deutsche Forschungsgemeinschaft” SFB 854/TP11 aan K.-D.F.
Materials
| VWR Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 |
| Pre-Separation Filters, 30 µm | Miltenyi | 130-095-823 |
| MZB and FOB cell isolation kit | Miltenyi | 130-100-366 |
| B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC | Biolegend | 103206 |
| CD21 / CD 35, clone 7G6, APC | BD Biosciences | 558658 |
| CD23, clone B3B4, PE | Biolegend | 101608 |
| HBSS | Biochrom | L2035 |
| D-PBS 1x | Gibco by Life Technologies | 14190-094 |
| BSA albumin fraction V, fatty acid-free | Roth | "0052.3" |
| ICAM-1 | R&D Systems | 796-IC-050 |
| Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated | Ibidi | 80601 |
| Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm | Ibidi | 10963 |
| Ibidi Pump system | Ibidi | 10902 |
Riferimenti
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
- Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged. Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).
- Steiner, O., et al. Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium. Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).
- Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).
- Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
- Cinamon, G., et al. Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone. Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).
- Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).
- Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).
- Schwab, S. R., Cyster, J. G. Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs. Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).
- Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).
- Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
- Tedford, K., et al. The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling. Nature Communications. 8 (1), 2261 (2017).
- ImageJ. MTrack2 Available from: https://imagej.net/MTrack2 (2018)
- . MTrack2 Available from: https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html (2018)
- . Chemotaxis and Migration Tool Available from: https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html (2018)
- Reeves, J. P., Reeves, P. A. Removal of lymphoid organs. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- . Manual Tracking Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html (2018)
- . ibidi Pump System Available from: https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html (2018)
