متعدد الفلورسنت المناعي تلطيخ والتصوير والتحليل في عينات نسيجية من سرطان الغدد الليمفاوية
Summary
هنا يمكننا وصف بروتوكول متعدد المناعي الفلورسنت تلطيخ والتصوير للترجمة المتزامنة متعددة المستضدات المرتبطة بالسرطان في الأورام اللمفاوية. ويمكن تمديد هذا البروتوكول لتحليل المؤشرات الحيوية داخل جميع أقسام الأنسجة كولوكاليزيشن.
Abstract
أساليب المناعي (المدينة) لتحليل التعبير البروتين بالفحص المجهري الخفيفة في الموقع أداة قوية للبحث وأغراض التشخيص. ومع ذلك، التصور والتقدير الكمي لمولدات المضادات المتعددة في مقطع واحد من أنسجة استخدام المدينة اللونية التقليدية يمثل تحديا. التصوير متعدد مهم خصوصا في أبحاث سرطان الغدد الليمفاوية، والتشخيص، حيث علامات يجب أن تفسر في سياق معقدة وورم المكروية. هنا يصف لنا وضع بروتوكول للمدينة الفلورسنت متعدد تلطيخ لتمكين التقييم الكمي لأهداف متعددة في خلية معينة أنواع المصالح في الأورام اللمفاوية. الأسلوب الذي يغطي جوانب من التحقق من صحة جسم، والأجسام المضادة الأمثل، الأمثل متعدد مع علامات لمفوما الأنواع الفرعية، تلطيخ الأنسجة الشرائح ميكرواري (تي أم أية)، ومسح الشرائح، متبوعاً بتحليل البيانات، مع محدد إشارة إلى سرطان الغدد الليمفاوية. باستخدام هذا الأسلوب، يتم إنشاء عشرات لكل شدة يعني علامة على الاهتمام والإيجابية النسبة المئوية تيسير المزيد من التحليل الكمي. الإرسال المتعدد يقلل استخدام العينة، ويوفر المعلومات المكانية لكل علامة للفائدة.
Introduction
الأورام اللمفاوية بسبب انتشار الخلايا الليمفاوية الخبيثة غير المنضبط. هذه الخلايا هي عناصر حيوية في الجهاز المناعي، وتعريب لأجهزة المناعة الأولية والثانوية، مثل نخاع العظام والعقد الليمفاوية والطحال ونظام اللمفاوية الأخرى المرتبطة بالغشاء المخاطي. الأورام اللمفاوية هي مجموعة غير متجانسة من الاضطرابات التي تصنف استناداً إلى كوكبة من الميزات، بما في ذلك مورفولوجيا، إيمونوفينوتيبي، والسمات الوراثية، والعرض التقديمي السريرية. بينما يلعب كل معلمة جزء، النسب ما زالت سمة المميزة ويشكل الأساس لنظام تصنيف منظمة الصحة العالمية التي تعترف بالأورام المستمدة من الخلايا ب وخلايا T القاتلة الطبيعية (ناغورني كاراباخ) الخلايا1.
وكان مفتاح للتصنيف للأورام اللمفاوية توصيف الأجسام المضادة ضد علامات سطح الكريات البيض من الأنواع الفرعية المختلفة للخلايا الليمفاوية2. إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) قد استخدم تقليديا لتحليل مثل هذه العلامات، ويستند إلى مبدأ الاعتراف ضد مستضد محدد للكشف عن الجزيئات المستندة إلى الخلايا والأنسجة التي يمكن تصور من خلال المجهر الخفيفة 3. بيد أن تحديد أهداف متعددة على شريحة واحدة من التقليدية مشرق حقل المدينة متعدد اللونية بقيود لأنه غالباً ما يصعب التمييز بين إشارات متعددة الألوان على مقطع نسيج واحد موثوق بها، لا سيما لمولدات المضادات مع تعبير منخفضة جداً4. التقييم البصري والتحديد الكمي لتلطيخ أيضا يمكن أن تكون ذاتية، تسبب تقلب في تفسير البيانات وتحليل5.
ولذلك، المدينة التقليدية على عينات (FFPE) الفورمالين–الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين ليس عمليا للكشف عن واحد من أهداف متعددة في أمراض متنوعة مناعي مثل الأورام اللمفاوية. وعلاوة على ذلك، التمييز بين الخلايا الليمفاوية الورمية من الخلايا المناعية المحيطة غالباً غير دقيقة. وهذا يعوق دراسات تبحث في أهمية المؤشرات الحيوية الرواية في الأورام اللمفاوية. وفي هذا السياق، يقدم المدينة الفلورسنت متعدد (وسط-المدينة) بديلاً واعداً كما أنها تتيح التقييم الكمي مستضد كوكسبريشن وعلاقة مكانية بدقة أعلى مع المحافظة على محدودية العينات6،7- عندما هذا تكنولوجيا التصوير هو في شراكة مع برنامج تحليل الصور الرقمية، تفسير البيانات أكثر كفاءة ويسهل دراسة الأورام والمكرويه التغايرية8،9. في هذا البروتوكول، أساس تيراميدي الفلورة (إذا كان) الإرسال المتعدد الأسلوب يتم تطبيقه على تضخيم الإشارات وهو متوافق مع أي جسم التحقق من صحة المدينة من أي الأنواع المضيفة، حتى تلك التي وضعت في نفس الأنواع5،7 , 10-يسمح البروتوكول على أساس تيراميدي لتصريف fluorophore لانسجة الاهتمام المباشر بحيث يمكن تجريده جسم الابتدائي والثانوي بعد كل خطوة، يسمح بتطبيق متسلسلة من البقع متعددة دون جسم ه.
استراتيجية متعدد ستكون مفيدة للتنبؤ بنتائج التشخيص والعلاج عن طريق تحديد الأهداف وأنماطها المناعية البديل في الأورام الليمفاوية. متعدد الفلورسنت المدينة قد طبقت في لدينا مختبر لدراسة فريق من علامات مساعد تي الحبيبي في أنجيويمونوبلاستيك تي خلية سرطان الغدد الليمفاوية (أيتل)، وعلامات تي وب اللمفاويات نوع فرعي الأورام اللمفاوية تي خلية الطرفية تتسم بالعدوانية السريرية السلوك والورم التغايرية11. ويتضح مدى فائدة هذا الأسلوب أيضا اللمفاوية ب-الخلايا الكبيرة منتشر (DLBCL)، مما يشير إلى زيادة في مستقبل خلايا ب مع التعبير المتزامن ج-حركة و BCL-2 تقترح فيها استخدام العلاجية المحتملة تيروزين كيناز تثبيط لبروتون 12 .
هنا يمكننا وصف بروتوكول كامل من التحقق من صحة جسم اختيار عنصر التحكم المناسب الأنسجة ومضاعفة استخدام لمفوما FFPE الآلي الأنسجة، مع تحليل في نهاية المطاف للشرائح ملطخة باستخدام المسح التصوير الكمي في علم الأمراض النظام.
Protocol
Representative Results
Discussion
وسط المدينة لديه القدرة على تمكين أخصائيي علم الأمراض لصقل دياجنوستيككريتيريا في علم الأمراض اللمفاوية وتحليل دور المؤشرات الحيوية في أنواع الخلايا المحددة تجاه تنبؤ بالنتائج السريرية. كأسلوب جديد في بحث، يتم تطبيق وسط المدينة متزايدة إلى تحديد الكمية والمكانية لمعلمات متعددة محصنة من…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
س-ب. ن. و A.D.J. معتمدة من قبل وزارة الصحة في “سنغافورة الوطنية الطبية المجلس الانتقال الجوائز البحثية” (نمرك/تا/0020/2013 ونمرك/تا/0052/2016). يعترف الكتاب “منحة بحثية يون سيو يونغ” إلى A.D.J. من “جامعة سرطان معهد سنغافورة الوطنية” نحو شراء مجهر التصوير الطيفي فكترا. وافقت هذه الدراسة “سنغافورة NHG المجال محددة استعراض المجلس ب” (2014/00693).
Materials
| Antibody diluent | DAKO | REF S3022 | Blocking |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | For peroxide blocking |
| Vectra multispectral automated microscope | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Spectral imaging |
| absolute Ethanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Ethyl alcohol for rehydration |
| Amplification Diluent | PERKIN ELMER | FP1135 | Fluorophore diluent buffer |
| Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Secondary antibody |
| Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Secondary antibody |
| BCL2 | DAKO | clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) | primary antibody |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | primary antibody |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | primary antibody |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) | primary antibody |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software |
Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Data Analysis software |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | primary antibody |
| KOS MILESTONE multifunctional tissue processor | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| Microwave | PANASONIC | NN-ST651M | Microwave stripping |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | mounting media |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for tissue section adhesion in routine histological use |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | nucleic acid stain |
| Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | For HIER |
| Tris Buffer saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | for buffer wash |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
Riferimenti
- Swerdlow, S. H., et al. . WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , (2017).
- Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).
- Dabbs, D. J. . Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , (2010).
- Kim, S. -. W., Roh, J., Park, C. -. S. Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Anderson, M. W., Natkunam, Y., Jones, D. Immunohistochemical profiling of lymphoma. Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. , 21-44 (2010).
- Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).
- Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Tóth, Z. E., Mezey, &. #. 2. 0. 1. ;. Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Ng, S. -. B., et al. Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).
- Bogusz, A. M., et al. Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence. PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).
- Kalyuzhny, A. E. . Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , (2011).
- Bordeaux, J., et al. Antibody validation. BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).
- PerkinElmer. . Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User’s Manual. , (2012).
- Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots. bioRxiv. , (2018).
- Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).
- PerkinElmer. . Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2017).
