צעד אחר צעד טיהור של מתחמי Macromolecular בעזרת RNA המצורפת ביוטין, מקשר צילום-cleavable
Summary
מתחמי RNA/חלבון מטוהרים באמצעות אסטרטגיה botin-streptavidin הם eluted פתרון תחת תנאים denaturing בטופס אינו מתאים עוד טיהור, אנליזה פונקציונלית. כאן, אנו מתארים שינוי של אסטרטגיה זו אשר מנצל מקשר צילום-cleavable RNA, צעד • UV-תנאי עדין, מניב את מתחמי ה-RNA/חלבון המקורי והמלא.
Abstract
במשך שנים רבות, חזק במיוחד, במהירות בנוי האינטראקציה בין ביוטין streptavidin יש כבר בהצלחה מנוצל לשם טיהור חלקי של מתחמי RNA/חלבון חשוב מבחינה ביולוגית. עם זאת, אסטרטגיה זו סובלת חיסרון מרכזי אחד המגביל את ניצול רחב יותר: האינטראקציה של ביוטין/streptavidin יכול להיות שבור רק תחת תנאים גם לשבש את תקינות מתחמי eluted, ומכאן מסלק denaturing שלהם אנליזה פונקציונלית עוקבות ו/או נוספות טיהור באמצעות שיטות אחרות. בנוסף, הדגימות eluted נגועים תכופות עם החלבונים רקע המשייכים nonspecifically streptavidin חרוזים, שמסבך הניתוח של מתחמי מטוהרת על ידי צביעת כסף ספקטרומטר מסה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פיתחנו משתנה של האסטרטגיה ביוטין/streptavidin בו ביוטין מצורף של המצע RNA באמצעות מקשר צילום-cleavable, מתחמי ותשמרו על חרוזים streptavidin הם eluted באופן סלקטיבי על פתרון טופס מקורי על-ידי גלי ארוך UV, עוזב את החלבונים רקע על החרוזים. סובסטרטים איגוד ה-RNA קצר יותר יכול להיות מסונתז כימית עם ביוטין והמקשר צילום-cleavable covalently מצורף לסוף 5′ RNA, ואילו עוד מצעים RNA יכול להתבצע עם שתי הקבוצות באמצעות oligonucleotide משלימים. אלה שתי גרסאות של השיטה • UV-תנאי נבדקו עבור טיהור של מתחמי עיבוד snRNP תלוית U7 זה קליב היסטון pre-mRNAs בקצה 3′ והוכיח שניהם להשוות לשני בחיוב בעבר פיתחו שיטות טיהור. הדגימות UV eluted הכיל כמויות לזיהוי בקלות snRNP U7 שהיה ללא מזהמים חלבון גדול ומתאים לניתוח ישיר באמצעות ספקטרומטר מסה מבחני פונקציונלי. השיטה המתוארת ניתן להיות ברצון הותאם עבור טיהור של מתחמי מחייב אחרים RNA, הפועל בשיתוף עם אתרי קישור יחיד, כפול-גדילי DNA לטהר חלבונים ספציפיים הדנ א ואת מתחמי macromolecular.
Introduction
ב פרוקריוטים, מבשרי RNA פולימראז II-שנוצרו mRNA (pre-mRNAs) עוברים מספר אירועים ההבשלה בגרעין לפני שהפך תקינים mRNA תבניות עבור סינתזת החלבון בציטופלסמה. אחד האירועים הללו הוא עיבוד קצה 3′. עבור הרוב המכריע של טרום-mRNAs, עיבוד קצה 3′ כרוך המחשוף מצמידים פוליאדנילציה. תגובה דו-שלבית זה מזורז על ידי קומפלקס יחסית שופע בהיקף של יותר מ-15 חלבונים1. בעלי חיים תלויי-שכפול היסטון pre-mRNAs מעבד בקצה 3′ מנגנון שונה שבו הוא שיחק תפקיד מפתח על ידי U7 snRNP, שפע נמוך מורכבים בהיקף של snRNA U7 של נוקלאוטידים ~ 60 וחלבונים מספר2,3 . U7 snRNA בסיסי זוגות עם רצף מסוים היסטון pre-mRNA, לאחד subunits של snRNP U7 מזרז את התגובה המחשוף, יצירת היסטון בוגרת mRNA ללא poly(A) זנב. 3′ עיבוד קצה של היסטון pre-mRNA דורש גם גזע לופ מחייב חלבון (SLBP), אשר נקשר שנשמרת גזע-לולאה ממוקם במעלה הזרם של אתר המחשוף ומגבירה את גיוס snRNP U7 המצע2,3. מחקרים שמטרתם זיהוי רכיבים בודדים של snRNP U7 היה מאתגר בשל ריכוז נמוך snRNP U7 בתאים בעלי חיים ואת הנטייה של המתחם מביצועם או עוברים proteolysis חלקית במהלך טיהור כתוצאה מהשימוש דטרגנטים קלים-4,–5,–6, שוטף מלח גבוהה ו/או מספר צעדים כרומטוגרפי7,8,9.
לאחרונה, כדי לקבוע את ההרכב של מכונות עיבוד U7 תלוית, נדגרה קטע קצר של ביוטין המכילים pre-mRNA היסטון 3′ או 5′ עם תמצית גרעיני, מתחמי שהורכב נתפסו על מצופים streptavidin agarose חרוזים5,6,10. בעקבות האינטראקציה בין ביוטין streptavidin חזק במיוחד, חלבונים ותשמרו על חרוזים streptavidin היו eluted תחת denaturing תנאים על ידי הרתחה ב מרחביות, נותחו על ידי צביעת כסף, ספקטרומטר מסה. בעת גישה פשוטה זו זוהו מספר מרכיבי snRNP U7, זה הניב דגימות גסה יחסית, לעיתים קרובות מזוהם עם מספר רב של חלבונים רקע מאוגדים nonspecifically streptavidin חרוזים, שעשוי להיות מיסוך רכיבים מסוימים של את מכונות עיבוד ומניעת אצלם הזיהוי על כסף מוכתם ג’לים5,6,10. חשוב, גישה זו גם מנעה כל מחקרים תפקודית ועם החומר המבודד שלו טיהור נוספת כדי הומוגניות על ידי שיטות נוספות.
הוצעו מספר שינויים לאורך זמן לפנות את אופי האינטראקציה ביוטין/streptavidin, עם רובם תוכננה גם להחליש את האינטראקציה או לספק זרוע מרווח מבחינה כימית cleavable ב כמעט בלתי הפיך ביוטין המכילות ריאגנטים11,12. החיסרון של כל השינויים האלה היה כי הם להפחית באופן משמעותי את יעילות השיטה ו/או נדרש לעיתים קרובות תנאים שאינם-פיזיולוגיים במהלך השלב • תנאי, לסכן את תקינות או פעילות של החלבונים מטוהרים.
כאן, אנו מתארים גישה שונה כדי לפתור את הבעיה הטבועה של האסטרטגיה ביוטין/streptavidin באמצעות ה-RNA סובסטרטים שבו ביוטין covalently מחובר 5′ סוף דרך 1 צילום-cleavable-(2-nitrophenyl) moiety אתיל זה רגיש זמן לנופף UV13,14. בדקנו גישה זו לטיהור של מכונות עיבוד U7 תלוית המגביל מ דרוזופילה ותמצית מידע יונקים גרעיני15. בעקבות של דגירה קצרה של ה-pre-mRNA היסטון ביוטין המכיל את מקשר צילום-cleavable עם תמצית גרעיני, מתחמי עיבוד שהורכב ותשמרו על streptavidin חרוזים, ביסודיות שטופים בעדינות פרסמה פתרון ביליד טופס על-ידי חשיפה לאור nm UV ~ 360. השיטה • UV-תנאי היא מאוד יעילה, מהירה וישירה, מניב כמויות מספיקות של snRNP U7 להמחיש מרכיביו מאת נכספת מכתים מ קטנה כמו 100 µL של תמצית15. החומר UV-eluted היא חינם של חלבונים רקע מתאים ניתוח ישירה ספקטרומטר מסה, צעדים נוספים טיהור מבחני אנזימטיות. יכול להיות מאומץ באותה השיטה לטיהור של אחרים מתחמי RNA/חלבון שדורשים אתרי קישור RNA קצר יחסית. ביוטין והמקשר צילום-cleavable יכול גם להיות covalently מצורף אל יחיד, כפול-גדילי ה-DNA, פוטנציאל הרחבת בשיטת UV-• תנאי לטיהור של מתחמי DNA/חלבונים שונים.
סינתזה של סובסטרטים RNA המכיל covalently מצורף ביוטין, מקשר צילום-cleavable היא מעשית רק עם הרצפים עולה על ~ 65 נוקלאוטידים, נהיה יקר ולא יעיל עבור רצפי באופן משמעותי יותר. כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו גם גישה חלופית מתאימה יותר מטרות איגוד ה-RNA. בגישה זו, ה-RNA של כל רצף נוקלאוטיד לאורכה שנוצר במבחנה על ידי שעתוק T7 או SP6 ואת annealed כדי oligonucleotide משלימה קצרה שמכיל ביוטין והמקשר צילום-cleavable בקצה 5′ (טרנס תצורה). דופלקס תוצאות משתמשים לאחר מכן לטהר את הפרט מחייב חלבונים או קומפלקסים macromolecular על חרוזים streptavidin בעקבות באותו פרוטוקול המתואר לשם סובסטרטים RNA שמכיל ביוטין cleavable-צילום מצורף covalently (חבר העמים תצורה). עם השינוי הזה, ביוטין צילום-cleavable ניתן להשתמש בשילוב עם במבחנה שנוצר תעתיקים המכיל מאות נוקלאוטידים, הרחבת בשיטת UV-• תנאי לטיהור של רחב טווח של RNA/חלבון.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת כאן היא פשוטה וחוץ שילוב מקשר צילום-cleavable, השלב • UV-תנאי אינו נבדל מן השיטות הנפוצות לנצל מאוד חזקה האינטראקציה בין ביוטין streptavidin. הצעד • UV-תנאי יעילה מאוד, בדרך כלל שחרור יותר מ-75 אחוזים הרנ א קיבוע ומקושרת מהחלבונים streptavidin חרוזים, כשמאחוריו רקע גבוה של חלבונים הלא ספציפית לא…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים העמיתים שלנו, משתפי פעולה על תרומתם לעבודה שלנו. מחקר זה נתמך על ידי NIH להעניק GM 29832.
Materials
| Streptavidin-Agarose | Sigma | S1638-5ML | |
| High-intensity, long-wave UV lamp | Cole-Parmer | UX-97600-00 | |
| Replacement bulb | Cole-Parmer | UX-97600-19 | 100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania) |
| RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis | Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | Requst a quote in Dharmacon | |
| Beckman GH 3.8 swing bucket rotor | Beckman | ||
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase) | Promega | P1300 | |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase) | Promega | P1280 | |
| Pierce Silver Stain Kit | ThermoFisher Scientific | 24612 |
Riferimenti
- Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3′-end processing. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
- Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d’Orval, B. Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).
- Dominski, Z., Marzluff, W. F. Formation of the 3′ end of histone mRNA: getting closer to the end. Gene. 396 (2), 373-390 (2007).
- Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 ‘-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).
- Sabath, I., et al. 3 ‘-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).
- Skrajna, A., et al. U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein. RNA. 23 (6), 938-951 (2017).
- Smith, H. O., et al. Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2′- O-methyl oligoribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).
- Pillai, R. S., et al. Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing. Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).
- Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein. EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).
- Yang, X. C., et al. A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 ‘-End Processing. Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).
- Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).
- Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
- Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable biotin phosphoramidite for 5′-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).
- Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules. Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).
- Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).
- Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. A 3 ‘ exonuclease that specifically interacts with the 3 ‘ end of histone mRNA. Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).
- Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Characterization of 3’hExo, a 3′ exonuclease specifically interacting with the 3′ end of histone mRNA. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).
- Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3’hExo ternary complex. Science. 339 (6117), 318-321 (2013).
- Mayeda, A., Krainer, A. R. Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing. Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).
- Dominski, Z., et al. 3′ end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system. Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).
- Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ‘ end processing of histone pre-mRNAs. Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).
- Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis. RNA. 8 (4), 426-439 (2002).
- Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3′ processing complex. Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).
- Thomas, M. F., L’Etoile, N. D., Ansel, K. M. Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways. Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).
- Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. TUT7 catalyzes the uridylation of the 3′ end for rapid degradation of histone mRNA. RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).
