Identification de codage et de Classes d’ARN Non codants exprimée chez le porc sang total

Séquençage de la génération suivant (NGS) a émergé comme un outil puissant pour l’étude des changements qui se produisent au niveau génomique d’organismes biologiques. Préparation des échantillons pour les méthodes end peut varier selon l’organisme, le type de tissu, et surtout les questions les chercheurs tiennent à adresse. De nombreuses études se sont tournés vers la NGS comme un moyen d’étudier les différences dans l’expression des gènes entre Etats comme des individus sains et malades^1,2,3,4. Le séquençage de prendre place sur une base de l’ensemble du génome et permet à un chercheur capturer la plupart, sinon tous, de l’information génomique pour un marqueur génétique particulière à la fois le point.

Les marqueurs plus courants d’expression observés sont les ARN messagers (ARNm). Les procédures plus utilisés pour préparer des bibliothèques pour RNA-seq sont optimisées pour la récupération des molécules d’ARNm au moyen d’une série de purifications, fragmentations et des trompes^5,6. Toutefois, la décision sur comment un protocole doit être effectuée dépend fortement du type de l’échantillon et les questions étant posées sur ledit échantillon. Dans la plupart des cas, l’ARN total est extrait ; Pourtant, pas toutes les molécules d’ARN sont intéressants et dans des cas tels que les études d’expression ARNm trop abondantes espèces d’ARN, comme l’ARN ribosomique (ARNr) doivent être éliminés afin d’augmenter le nombre de transcriptions décelables associée à l’ARNm. La méthode la plus populaire et largement utilisée pour éliminer les molécules d’ARNr abondante est la réduction des transcriptions polyadénylé RNA dénommé polyA appauvrissement de la couche⁷. Cette approche fonctionne bien pour l’analyse de l’expression de l’ARNm qu’elle n’affecte pas la transcription de l’ARNm. Toutefois, dans les études qui sont intéressent à des ARN non codants ou virales, l’appauvrissement de polyA supprime également ces molécules.

De nombreuses études choisissent de se concentrer sur la préparation de bibliothèque de séquence ARN afin d’examiner l’expression de l’ARNm (codage) ou une classe particulière d’ARN non codants de petite ou grande. Bien qu’il existe d’autres procédures⁸ comme le nôtre qui permettent la préparation de l’échantillon double, nombreuses études préparent de bibliothèques à partir des échantillons distincts pour des études distinctes lorsqu’ils sont disponibles. Pour une étude comme la nôtre, il faudrait normalement plusieurs échantillons de sang, augmentant le stress animal, consommables et temps. L’objectif de notre étude était d’être capable d’utiliser le sang d’animaux pour identifier et quantifier les différentes classes de deux ARNm et non-codantes RNA exprimée entre sain et hautement pathogène dysgénésique et le virus du syndrome respiratoire (HP-PRRSV) contesté de porcs^9,10 en dépit d’avoir seulement un échantillon simple de sang total (2,5 mL) de chaque cochon. Pour ce faire, il nous fallait optimiser l’extraction typique et les protocoles de création de bibliothèque pour générer les données appropriées permettant l’analyse des ARNm et non-codantes RNA (ARNnc) expression¹¹ auprès d’un échantillon unique.

Cela a incité un besoin pour un protocole qui permettait d’ARNm et d’analyse de RNA non-codantes parce que les kits standards disponibles et méthodes d’extraction de l’ARN et bibliothèque de création étaient destinés principalement à des ARNm et utilisent une déplétion de poly-A étape¹². Cette étape aurait rendu impossible de récupérer des ARN non codants ou transcriptions virales de l’échantillon. Par conséquent, il fallait une méthode optimisée qui a permis d’extraction de l’ARN totale sans appauvrissement de polyA échantillon. La méthode présentée dans ce manuscrit a été optimisée pour permettre l’utilisation de sang comme un type d’échantillon et pour construire des librairies de séquençage de l’ADN messagère et ncRNA de petites et grandes tailles. La méthode a été optimisée pour permettre l’analyse de tous les ARN de non-codage détectable mais aussi de conserver l’ARN viral pour l’enquête ultérieure¹³. Dans l’ensemble, notre protocole de préparation de Bibliothèque optimisée permet d’enquête sur les multiples molécules d’ARN auprès d’un échantillon de sang total unique.

L’objectif derrière l’utilisation de cette méthode était d’élaborer un processus qui a permis pour la collecte de non-codage ARN et ADN messagère dans un échantillon de sang entier. Cela nous permet d’avoir ARNm, ARNnc et l’ARN viral pour chaque animal dans notre étude proviennent d’un seul échantillon⁹. Ceci, en fin de compte, permet la découverte plus scientifique sans animaux surcoûts et donne une image plus complète de l’expression de chaque échantillon individuel. La méthode décrite permet l’examen des régulateurs de l’expression des gènes comme permettant à l’achèvement des études de corrélation en comparant les deux ARNm et expression de RNA non codantes en utilisant un échantillon simple de sang total. Notre étude a utilisé ce protocole pour examiner les changements dans l’expression des gènes et des régulateurs épigénétiques possibles dans virally infectés 9 – vieux semaine commerciales verrats.